9.5.2 提高外源基因表达的策略
1.构建含MARs的表达载体
核基质结合区（matrix attachment regions，MARs）是细胞中与核基质特异性结合的一段DNA序列。大多数MARs位于基因两侧非编码区，富含AT和保守的结构域。其最小活性序列为300 bp，常与增强子、启动子、复制起始位点等重要元件相邻。MARs可以作为边界因子和染色质调控因子对外源基因的表达发生作用。
转基因发生时，外源基因随机插入植物的基因组DNA中。如果插入位点的染色质呈紧密排列状态，则很容易发生外源基因的沉默现象。在基因转录单元两侧连接MARs之后，MARs与核基质结合形成一个相对独立的疏松染色质loop结构，可以减少同源依赖的基因沉默，使外源基因保持较高的转录活性，从而提高表达效率。
另外，MARs可以作为边界因子限定基因调控的独立区域，阻止调控因子超越边界的调节作用。植物体内存在很多内源的调控因子，可以增强或减弱基因的表达。MARs位于基因的侧翼时，可以把其限定区域之外的调控因子与基因隔离开。
2.选择组织特异性或诱导型启动子
转基因植物研究中常用的启动子按来源一般分为病毒来源的CaMV 35S启动子、植物来源的玉米泛素（ubiquitin）基因启动子和人工合成的启动子元件（G-box motif）。这些启动子能引导外源基因在转基因植株的各组织中表达，但不能从时间和空间上对其进行有效调控。因此不仅造成了表达产物的浪费，而且在质外体、液泡等器官中因表达产物的过度积累对植株本身的生长发育造成不良影响。而组织特异型启动子或诱导型启动子引导外源基因在植物发育过程中某一特定时间或特定空间表达，则可减缓这一现象的发生。
组织特异型启动子可在根、叶片和叶脉、韧皮部、木质部、花粉绒毡层、果实、胚等器官或组织中特异表达，而且大部分组织特异型启动子活性强于组成型启动子。马铃薯MCP-1启动子可引导外源基因在块茎和浆果中特异表达；子房特异型启动子TPRP-F1在促进番茄的单性结实上也有很好效果，而且不影响果实大小和形态。
对诱导型启动子的研究相对较少，根据作用类型可将其分为三类：A型启动子受植物体内合成的某些产物，如脱落酸（ABA）、生长素或受创伤诱发的活性物质诱导；B型启动子受高温、低温、高浓度盐离子和重金属离子的环境胁迫诱导；C型启动子受外源化学诱导物如四环素、苯并噻二唑（BTH）等诱导。由于可以对外源基因的表达进行适时调控，理论上可以人为控制基因表达的时间或顺序，因此具有较大的应用前景。
3.降低外源基因的拷贝数
外源基因通过常规的方法转化往往以多拷贝形式存在于植株基因组内。但拷贝数的增加并不一定使表达水平增强，反而更易引起重复序列间的异位配对导致基因沉默。可以在转基因再生植株的当代选择，也可以从多拷贝整合植株的有性生殖分离后代中选择。切实可行的途径是选择适宜的转基因方法，提高单拷贝转基因植株的比例。
4.利用引导肽进行表达产物的定位
外源基因在植物组织细胞中表达时，其表达产物受细胞中大量蛋白酶的作用而降解，造成外源蛋白积累量的减少。因此，采取措施保护外源蛋白不受降解是实现转基因成功的重要环节。外源基因的表达产物会受细胞内蛋白酶的降解，而在接入引导肽序列对蛋白质进行定位后可以提高蛋白质的含量。
Edith和Catherine在研究拟南芥Rubisco小亚基的引导肽序列时，发现接入引导肽后基因在叶片中的表达效率提高了10～20倍。植物合成的蛋白质中有2000～3000种要定位于叶绿体上，此过程中引导肽起到主要作用。如番茄PEND蛋白的16个氨基酸的引导肽序列能进行叶绿体定位。
5.建立位点特异性重组系统
一般的转基因方法外源基因在基因组中的整合是随机的，利用位点特异性重组系统如Cre-lox、FLP-frt则可以将转化基因精确整合到基因组中含单拷贝的既定位点。Cre-lox系统由相对分子质量为3.815×106的Cre重组酶和34 bp lox位点组成，野生的lox位点被称为loxP，由2个13 bp的反向重复序列和1个8 bp的间隔区组成，由于间隔区为非对称序列，因此使得lox位点具有方向性。在细胞和离体系统中，当2个loxP方向相同时，在Cre重组酶的作用下，loxP之间的DNA片段被切除；当2个loxP方向相反时，两端携带loxP的DNA片段会发生倒位；如果loxP不在同一分子上，例如一个在质粒DNA上，而另一个在某条染色体上，那么质粒DNA将整合到染色体中loxP所在的位置上，实现定点整合。定点整合通常分为两步：首先按常规方法随机整合进一个lox位点，使其成为载体整合的靶位点；在随后的第2轮转化中，携带另一个lox位点的T-DNA与染色体中原有的lox位点整合，从而使得插入的DNA具有特异性和准确性。因此，建立位点特异性重组系统，可以在既定位点整合目的基因，是一种获得高效稳定表达的转基因植株的策略。
6.叶绿体和线粒体转化的应用
在高等植物细胞中，除细胞核内存在DNA外，叶绿体和线粒体内也存在部分DNA，因此，理论上存在进行遗传转化的可能性。由于植物细胞中含有多个叶绿体，因此将外源基因导入叶绿体基因组中时会使该基因在细胞中的拷贝数迅速增加，可大大提高转化基因的表达效率。而且在叶绿体中表达的蛋白质避免了翻译后的修饰作用，提高了表达的蛋白质的数量。另外，叶绿体转化时可通过构建定位片段使目的序列与叶绿体基因组同源序列间进行重组，实现外源基因的定点整合。同时，由于叶绿体具有母系遗传性，目的基因在后代中的性状分离不遵循孟德尔定律，故转化基因可在子代中稳定地遗传和表达。
线粒体内存在的部分DNA也可以用来进行基因的独立表达。外源基因在线粒体内有高精度转录、准确编辑等特点，因此，也具有很大的研究价值。
7.其他策略
不同来源的基因在不同物种中的表达效率差异较大。如果外源基因来自原核生物，由于表达机制的差异，这些基因的mRNA在植物体内往往不稳定，表达产物含量低。通过选用植物偏好的密码子，去除富含AT的不稳定元件等一系列措施，可大幅度提高外源基因的表达量。如对Bt基因的改造，则是在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选用植物偏好的密码子，增加了GC含量，去除原序列中影响mRNA稳定性的元件。结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍，获得了明显的抗虫效果。
内含子虽然一般并不参与编码多肽，但具有其特定的生物学功能。其中一个重要的功能就是增强外源基因在受体中的表达。目前已知的能增强外源基因表达的内含子来自玉米脱氢酶、玉米泛素蛋白、玉米肌动蛋白、水稻肌动蛋白、矮牵牛的1，5-二磷酸核酮糖羧化酶小亚基、马铃薯的光诱导组织特异性蛋白等基因。