7.2.1 原核细胞表达系统概述
1.原核细胞表达载体
1）原核细胞表达载体的特点
原核细胞表达载体是指能携带插入的外源核酸序列进入原核细胞中进行表达的载体。原核细胞表达载体主要有质粒载体、噬菌体载体和人工染色体等。目前已经构建了多种原核细胞表达载体，通常对原核细胞表达载体的基本要求如下：
（1）复制子：复制子是含有DNA复制起始位点和反式因子作用区的DNA片段，其功能是通过复制使质粒在受体细胞内大量扩增和传代。质粒中复制子的复制能力决定每个细胞内质粒的拷贝数。在通常情况下，基因剂量与合成的基因产物之间存在非线性的正相关关系，但在质粒拷贝数达到一定的阈值后，质粒拷贝数的增加并不能使目的基因产物同步增加，相反会产生一些副作用，主要表现为对细胞生长能力的损害和质粒本身编码的蛋白质过量积累。因此，根据需要选用适合类型的复制子对于构建质粒表达载体是相当重要的。如果需要两个质粒共转化，还要考虑复制元是否相容的问题。
（2）筛选标记和报告基因：表达载体上必须含有表型选择标记，才能把转化体从大量的菌群中分离出来。微生物表型选择标记可分为显性标记和营养缺陷型标记。例如，大多数微生物对抗生素敏感，因此质粒上携带的抗生素抗性基因可作为最常见的显性选择标记，把转化成功的菌体轻而易举地挑选出来。抗性筛选标记主要有氨苄青霉素、卡那霉素、新霉素、四环素、红霉素和氯霉素等。抗性基因的选择要注意是否会对研究对象产生干扰，比如代谢研究中要注意抗性基因编码的酶是否和代谢物相互作用。在使用抗生素时要注意温度的控制，温度过高容易导致抗生素失效。另外一种转化体检测是通过报告基因实现的。通常的报告基因有绿色荧光蛋白、半乳糖苷酶、荧光素酶等。此外，一些融合表达标签也有报告基因的功能。
（3）启动子和终止子：启动子是RNA转录不可缺少的重要顺式作用元件。通常启动子具有特定的保守序列区域，但在不同的生物中，这些保守区域的序列会有所不同。保守区域序列的改变会影响RNA聚合酶识别和结合能力。根据保守区域序列的不同，具有强、弱启动子之分。启动子的相对强弱对基因表达量具有决定性的影响。根据转录模式，基因表达可分为组成型表达和诱导调控型表达。常见的原核细胞表达载体启动子如表7-1所示。大量的外源基因表达可能对宿主有毒害作用，影响宿主的生长，所以表达载体应带有诱导性表达所需要的元件，即有操纵子序列以及与之相应的调控基因等。转录终止子对外源基因的高效表达也有重要作用，即控制转录的RNA长度，提高系统的稳定性，避免质粒上异常表达导致质粒稳定性下降。放在启动子上游的转录终止子还可以防止其他启动子的通读，降低本底水平表达。
表7-1 原核细胞表达载体常用启动子种类及结构组成
续表
（4）核糖体结合位点：在起始密码子AUG上游7～13 bp处有一富含嘌呤的区域，称为SD序列。SD序列能与16S rRNA3'端互补配对，形成翻译起始复合物，这对有效地进行蛋白质翻译是必需的。多数表达载体有SD序列，也有些表达载体没有SD序列。虽然缺乏SD序列的mRNA也能进行蛋白质的翻译，但效率明显降低。因此，为了提高外源基因的表达水平，可将外源基因编码区插入SD序列下游，使外源基因的翻译起始效率显著地提高。
（5）克隆位点：外源基因需要插入载体合适的位置上，所以表达载体要有合适的多克隆位点（multiple cloning site，MCS）或多位点接头。这些位点在载体上通常是独一无二的，这样可以防止插入片段插入不恰当的位置。多克隆位点的存在可以确保载体适合大部分的DNA片段，可以针对插入片段提供特定的酶切位点图谱，提高质粒重组操作的灵活性。在选择质粒载体时，既要考虑多位点接头的位置，又要考虑多位点接头的顺序，保证插入序列的方向性。
（6）载体大小：大的质粒不会很好地转化，而且DNA产量通常很低。在设计实验时，要考虑到加入插入片段的最终载体的大小，尽量用小的载体。
2）表达载体的选择
表达系统的核心是表达载体。用来表达外源基因的载体有很多种，一般来说，这些载体应满足以下要求：①重组质粒拷贝数高，表达量高；②适用范围广；③表达产物容易纯化；④在菌体内稳定性好。
目前已知的应用较广的表达载体有非融合表达载体、融合表达载体、分泌型表达载体和表面呈现表达载体等。
（1）非融合表达载体：其优越性在于表达的非融合蛋白与天然状态下存在的蛋白质在结构、功能以及免疫原性等方面基本一致，从而可以方便地进行后续研究。为了提高翻译效率，在设计表达载体时采用了许多方法，例如：①优化翻译起始区以达到高效表达；②构建一套SD-AUG间隔不等的表达载体以供选择利用；③在构建表达载体时，使用近年来发现的“原核翻译增强子”序列，以提高翻译效率；④将“原核翻译增强子”和双顺反子结构结合到一起，从而提高表达效率。
（2）融合表达载体：将外源蛋白基因与受体菌自身蛋白基因重组在一起，但不改变两个基因开放阅读框，以这种方式表达的蛋白称为融合蛋白。表达融合蛋白的一般模式如下：原核启动子—SD序列—起始密码子—原核结构基因片断—目的基因序列—终止密码子。目前成功的融合表达载体包括GST（谷胱甘肽S转移酶）系统、半乳糖苷酶系统、麦芽糖结合蛋白（MBP）系统、蛋白A系统、纯化标签融合系统等。由于翻译起始信号在调控翻译强度中是最重要的，融合表达载体SD-AUG间隔通常已固定，翻译起始信号组织合理，有利于翻译起始，且简化了蛋白质分离纯化步骤。将相对分子质量较小的蛋白质以融合蛋白形式表达，可增强mRNA及表达产物稳定性，并生产出可溶性蛋白。
（3）分泌型表达载体：为减少所需蛋白质在宿主体内被蛋白酶降解的量，或者使蛋白质能够在体外正确折叠和便于提纯，经常需要将被表达的蛋白质分泌到细胞外，因此要用分泌型载体。表达分泌蛋白是防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象的最有力措施。利用分泌型表达载体的优点如下：①一些在胞内被蛋白酶降解的蛋白质在细胞周质中很稳定；②一些在胞内无活性的蛋白质分泌后便具有活性，分泌可能使蛋白质能够正确折叠；③产生的蛋白质没有氨基酸末端甲硫氨酸，因为切割位点在信号肽与编码序列之间，甲硫氨酸会影响许多蛋白质的活性。
（4）表面呈现表达载体：表面呈现表达技术分为两种：一种是噬菌体表面呈现表达技术，另一种是细菌表面呈现表达技术。例如对于大肠杆菌来说，有三种呈现方式：①将目的基因克隆入外膜蛋白的表面暴露部位的loop区，可将较小的肽呈现到外膜；②将目的基因克隆入鞭毛或纤毛的结构基因中；③将目的基因融合到脂蛋白、IgA蛋白酶等的N端或C端。此载体由于表达量低，只适用于一些对蛋白质性质方面的研究、筛选文库等。
2.原核受体细胞
受体细胞是指在转化和转导（感染）中接受外源基因的宿主细胞。在原核细胞表达系统中，最常用的宿主细胞有大肠杆菌、芽孢杆菌、链霉菌和蓝藻等。作为受体细胞，必须具备下面的性能：①易于接纳外源DNA；②限制酶缺陷型（或限制与修饰系统均为缺陷型）；③DNA重组缺陷型，DNA不易转移，遗传稳定性高，易于进行扩大培养；④无致病性，不适于在人体内或在非培养条件下生存；⑤载体复制、扩增不受阻；⑥与表达载体有互补性，同时，表达载体所含的选择性标记与受体细胞基因型必须匹配；⑦受体细胞内源蛋白水解酶基因缺失或蛋白酶含量低，有利于外源基因蛋白表达产物的积累；⑧受体细胞在遗传密码子的应用上无明显偏好性，有利于外源基因的高效表达；⑨可使外源基因高效分泌表达；⑩具有好的翻译后加工机制，便于真核基因的表达等。
根据宿主细胞的类型，可将原核生物基因表达系统，大致分为大肠杆菌表达系统、芽孢杆菌表达系统、链霉菌表达系统和蓝藻表达系统等。