13.1.1　蛋白质工程的理论基础

酶的专一性强，在温和条件下有效地催化化学反应的能力使酶的应用日益广泛。药品、化学、食品工业及分析服务行业是酶开发的重要领域。目前已知的酶有8000多种，至少有2500种有可能应用，而目前国际上工业用酶约为50种，以吨级出售的仅20余种，可见，酶的开发利用尚有较大潜力。妨碍酶开发利用的主要原因如下：①生物材料中酶含量甚少，用传统酶蛋白的分离纯化成本太高；②酶蛋白分子结构的稳定性差，酸性或碱性过强、高温、氧化等因素均可破坏其结构，使其丧失生物活性，因而在工业加工条件下，酶的半衰期短，利用率较低；③酶催化活性的最适pH值及底物专一性的范围较窄，与工业应用的要求有较大差距。因此，要想扩大酶蛋白的开发利用，需要建立适当的方法，以改善酶蛋白的生物特性，使之适合于工业应用的要求。

随着基因工程理论和技术的发展，已经能克隆特异酶基因，并令其在适宜宿主菌中表达，使酶的产量大大提高，因而降低酶纯化成本的问题已基本解决。重要的是提高酶蛋白的稳定性，改良其生物学特性。

稳定蛋白质空间构象的主要因素是蛋白质分子众多基团间的相互作用，如肽键和侧链间的氢键、带有不同电荷的侧链间的静电作用、极性氨基酸残基侧链间的偶极作用、疏水残基间的疏水作用以及分子内的二硫键等。蛋白质结构与功能研究表明，上述稳定蛋白质空间构象的因素是由蛋白质一级结构中某一个或某一段氨基酸序列决定的，人工改变或修饰这些氨基酸残基，有可能增加蛋白质的稳定性，又不影响其生物学活性。如野生型枯草芽孢杆菌蛋白酶的218位Asn是与酶活性有关的氨基酸残基，若将其变成Ser，用65℃的失活半衰期衡量，从59 min增加到223 min，酶的稳定性显著增加。再如氧化失活使枯草芽孢杆菌蛋白酶在工业上的应用受到严重限制。很早就有人证实枯草芽孢杆菌蛋白酶在少量H2O2作用下很快失活是由于埋藏在催化部位Ser221邻近的Met222氧化成硫氢化物。1985年Wells证明若用其他氨基酸取代Met222，可以提高酶的氧化稳定性而又保持其高催化活性。

以上以酶为例介绍了蛋白质工程的重要性。实际上，在多肽药物、抗体以及其他活性蛋白质的基础与应用研究中，同样存在着蛋白质结构的改造问题。如白细胞介素-2（IL-2）是一种免疫反应调节因子，在医学上具有广泛的用途。结构研究证明，IL-2是由133个氨基酸残基组成的多肽，有3个半胱氨酸残基、1个二硫键，而125位上的半胱氨酸残基处于游离状态，这可能与其结构的稳定性有关。在分离纯化IL-2的过程中，发现在产品纯化和恢复活性过程中，IL-2多肽链中的3个半胱氨酸残基之间易发生二硫键错配，致使整个多肽活性降低。对此，科学家通过定点诱变将编码链上编码125位半胱氨酸残基的密码子TGT转换成TCT或GCA，也就是把半胱氨酸残基转换成丝氨酸残基或丙氨酸残基，结果可以避免二硫键的错配，使产品IL-2的活性提高了7倍。可见，改造蛋白质的空间结构以改变蛋白质的某些生物学特性，在拓宽蛋白质的用途、推动生物技术产业化方面至关重要。而蛋白质精细结构的改造，只有利用蛋白质工程技术才能得以实现。

蛋白质工程的重要目标之一，是通过改造蛋白质的结构来提高其开发利用的价值。这就是说，蛋白质的结构改变了，其生物学功能不能变。蛋白质的功能是由其结构决定的，蛋白质的结构改变了，其生物学功能能保持不变吗？蛋白质结构与功能关系的研究表明，蛋白质功能部位的几个氨基酸残基决定着蛋白质的功能，但是这几个负责功能的氨基酸残基必须处于一个极其精密的空间状态下才能发挥功能。这就是说，只要能维持蛋白质结构域的必需氨基酸残基及空间构象不变，其功能域的生物学活性就会保持不变。变异研究已经证明，许多蛋白质分子中多个氨基酸残基被改变，但其生物学功能不受影响或只受极少的影响。事实上，在许多个体中已发现一些变异蛋白质，伴有氨基酸残基的插入、丢失或替换，但蛋白质仍保持正常功能。如前所述，将枯草芽孢杆菌蛋白酶催化部位Ser221邻近的Met222置换，可以提高该蛋白酶的抗氧化性，又能保持催化活性，就是一个典型的例子。随着蛋白质三维结构分析技术的不断发展，借助于计算机对蛋白质结构域与功能域信息的处理及设计，采用定点诱变技术从基因水平改变氨基酸残基编码顺序，即可获得与天然蛋白质的理化性质相异而生物活性相似的突变蛋白质。

生物技术的兴起使得分子生物学的理论与工程实践紧密结合。20世纪70年代初期，重组DNA技术诞生，并成功地应用于基因操作，从而产生了基因工程。而基因工程的诞生，特别是重组DNA技术和基因定点诱变等技术的建立，使我们有可能从基因水平改造蛋白质分子中氨基酸序列，为蛋白质工程的诞生奠定了技术基础。所谓基因定点诱变，就是在DNA水平上，通过对蛋白质结构基因中某个或某些氨基酸残基编码序列加以改变，从而改变蛋白质结构。该技术不仅可用于改造天然蛋白质，而且可以用于确定蛋白质中每一个氨基酸残基在结构和功能上的作用，以收集有关氨基酸残基线形顺序与其空间构象和生物学活性之间的对应关系，为人工改造蛋白质提供理论依据。

总之，蛋白质结构和动力学研究是蛋白质结构与功能关系研究的重要手段，而改造蛋白质结构，则依靠基因工程，基因工程的发展从技术上提供了改变蛋白质个别氨基酸残基或肽段的手段，使结构改变已能在实验室实施，两者结合则产生了蛋白质工程。