3.6.4　慢病毒

慢病毒（lentivirus）是逆转录病毒家族中的一个分支，由于其基因组较简单型逆转录病毒更加复杂，因此也被称为复杂型逆转录病毒。最著名的慢病毒为人免疫缺陷型病毒1（HIV-1）。

1.慢病毒结构

慢病毒结构和简单型逆转录病毒结构相似，它是含有脂质双层被膜结构的病毒，内部基因组同样为一条单链RNA，长度为7～12 kb。慢病毒基因组中除含有简单型逆转录病毒所包含的相同基因（gag、pol和env）外，还含有其他6个基因，包含2个调控基因和4个附属基因，这6个基因在慢病毒对宿主细胞的结合、感染、病毒复制和子代病毒释放过程中发挥重要作用（表3-6）。

表3-6　慢病毒基因组部分基因的功能（不包含和简单型逆转录病毒相同的基因）

这些基因对于慢病毒载体是非必需的。在包装辅助细胞系中只含有编码rev、gag、pol和env基因的质粒。

最常用的慢病毒载体是由HIV-1病毒改造而来，其改造过程和简单型逆转录病毒载体非常相似，这些载体中的编码基因几乎全部被删除，只保留一个调控基因和病毒包装所需要的序列，删除这些编码区域为外源基因的插入提供了更大空间。制作重组慢病毒载体时需要将三种质粒转染进入辅助细胞系HEK293或293T中，第一种质粒含有gag、pol和rev基因，第二种质粒含有env基因，第三种质粒为慢病毒载体和外源基因的重组体。当同一个辅助细胞中导入这三种质粒，辅助质粒中的基因表达产物可以引导慢病毒重组载体进行子代病毒包装。

2.生命周期

慢病毒的生命周期属于典型逆转录病毒生命周期。首先，病毒被膜的糖蛋白结合细胞表面特定受体，接下来病毒被膜和宿主细胞被膜相互融合，病毒核心被释放进入宿主细胞质中。这种内吞作用完成不久，在病毒逆转录酶作用下，单链RNA被逆转录成dsDNA，并和基因组DNA整合在一起。慢病毒和简单型逆转录病毒相比，生命周期的主要差异在于：①慢病毒基因的表达过程分为两个阶段，即早期阶段和晚期阶段，这两个阶段的分界点为病毒rev蛋白与病毒基因组相结合的时间；②利用病毒vpr蛋白的作用，慢病毒可以感染非分裂期细胞；③tat基因是复杂型逆转录病毒所特有的基因，参与HIV-1病毒的复制过程。

对野生型慢病毒的改造修饰过程可以改变慢病毒载体的特定生命周期，保证病毒载体的应用过程更加安全，使载体更符合应用的需求。例如，慢病毒自我钝化表达载体（sin）的U3启动子区域被删除，会引起病毒前体失活，这种载体限制了病毒基因组在宿主细胞中转移的能力，并限制了病毒基因组和宿主细胞基因组重组的能力。在通常情况下，用于基因治疗研究的慢病毒载体的被膜为一种特殊的糖蛋白，例如泡状口腔炎病毒糖蛋白（VSV-G），这种糖蛋白可以使病毒载体感染更多类型的细胞。

3.基因治疗应用研究

慢病毒载体和简单型逆转录病毒载体相比有很多优势。例如，慢病毒载体可以感染小鼠胚胎和大鼠胚胎生产转基因动物，而且可以控制外源基因组织特异性表达，慢病毒对外源DNA的承载量相对也更高，慢病毒可以感染非分裂期细胞。

由于慢病毒载体可以感染非分裂期细胞，因此它在慢病毒应用研究的早期就用于针对非分裂细胞的转基因研究。例如，神经系统和心脑血管系统的基因治疗研究。2002年首次将慢病毒用于临床试验，第一个被批准进行临床试验的慢病毒载体治疗方案是VRX496，这是一种利用抑制因子进行抗艾滋病的RNA治疗方案。研究证明这种重组载体是安全的，具有短期治疗效果。此外，慢病毒载体也被用于其他疾病的治疗研究，例如脑白质肾上腺萎缩症（adrenoleukodystrophy，ALD）、渐进性神经变性疾病（这种神经病变可以引起中枢神经系统发生弥散性脱髓鞘作用）、帕金森病、镰刀状细胞贫血和地中海贫血症、艾滋病（HIV）和癌症的免疫治疗等。