11.2.1　基因过表达技术的基本流程

基因过表达技术是研究基因功能必不可少的方法之一，其基本步骤包括基因过表达载体的构建、转化入宿主细胞、筛选目的产物过量积累的转化子和基因功能的分析。

基因过表达载体的构建是实现基因过表达的关键步骤。表达系统一般可分为组成型和诱导型两种，其中组成型表达系统能够使外源蛋白时刻处于表达状态，如pTREX系列的质粒载体，此类载体往往对宿主细胞产生代谢压力。另一种为诱导型表达系统，外源基因的表达可通过诱导物、环境的改变等因素来进行调控，如糖诱导、温度诱导等。如为了研究谷氨酸脱羧酶基因gadB对乳酸乳球菌生产氨基丁酸性能的影响，首先构建了pNZ8148质粒，该质粒全长3165 bp，含有nisA启动子，由乳酸链球菌素诱导表达，同时具有氯霉素抗性，便于筛选。GAL4-UAS系统是比较有代表性的过表达系统，于1993年在果蝇中建立，由GAL4（酵母中一种转录激活因子）和UAS（酵母中GAL4的增强子序列）组成。该系统中将GAL4基因与强启动子或增强子连接后成为GAL4转基因系，UAS序列与靶基因相连接而成为UAS-靶基因转基因系，只有UAS存在时靶基因不表达，当UAS和GAL4杂交后，GAL4蛋白才能与UAS序列结合，使靶基因转录表达（图11-5）。该系统不仅可以使目的基因过量表达，而且可以使目的基因在特定的时期、特定细胞中表达。同时可借助该系统在不同组织及不同发育时期进行分析，实现异位表达，可用于综合分析基因的功能。

图11-5　GAL4-UAS系统示意图

（引自李春峰等，2006）

将目的基因与过表达载体连接后即形成重组载体，将重组载体导入宿主细胞，如大肠杆菌、酵母细胞、哺乳动物细胞等，此过程称为转化或转染。常用的方法包括电穿孔转化法、脂质体介导法、显微注射法等，根据宿主细胞的不同可选择合适的导入方法。外源基因与表达载体连接后的重组载体进入宿主细胞后，外源基因在宿主细胞中整合、过表达，可通过重组载体中的筛选标记筛选目的产物过量积累的转化子，如抗药性筛选法、显色互补筛选法、原位杂交法、免疫化学检测法等。筛选所得重组子可采用PCR法、Western印迹法检测靶基因的过表达效率，进而通过表型的差异研究某一基因的相关功能。