4.1.3 RNA的提取
在RNA的提取中，所得RNA的完整性和均一性是判断提取成功与否的主要指标。而RNA的完整性和均一性与实验材料及提取过程中RNA酶（RNase）活性的抑制密切相关。
1.实验材料
（1）样品的要求：最好使用新鲜的样品或取样后立即在低温（—20℃或—70℃）冷冻保存的样品，避免反复冻融，否则会导致提取的RNA降解和提取量下降。
（2）样品预处理：从不同来源样品（如细菌、酵母、血液、动物组织、植物组织和培养细胞），或同一来源样品的不同组织（如植物幼嫩叶片、成熟根、茎等）中提取高质量的RNA，样品预处理的方式因细胞结构及所含的成分不同也各有差异。如植物材料一般用液氮研磨；动物材料一般匀浆，用液氮研磨；细菌一般用溶菌酶破壁；酵母一般用液氮研磨，玻璃珠处理，混合酶破壁。
2.RNase的抑制
RNase是导致RNA降解最主要的物质。此酶非常稳定，在一些极端的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制剂不能使所有的RNase完全失活。在RNA提取过程中RNase按来源主要有外源性与内源性两种。
（1）外源性RNase的抑制。外源性RNase主要来自实验过程所用仪器及试剂，因此实验中一般采取下列措施对其进行抑制：所有的玻璃器皿应置于烘箱中（180℃）烘烤4～8 h，凡不能高温烘烤的材料（如塑料器皿等）皆应用0.1％焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）水溶液处理，再用洁净的蒸馏水冲洗；所有RNA提取中所用的水先用0.1％DEPC 37℃处理12 h以上，再经高压灭菌；全部实验过程中均需戴手套操作，并经常更换。RNA电泳槽需用去污剂洗涤，用水冲洗，乙醇干燥后，浸泡于3％H2O2溶液中，室温放置10 min后，用0.1％DEPC溶液彻底冲洗。
（2）内源性RNase的抑制。内源性RNase主要来自实验材料，当实验材料破碎后，细胞内的RNA与RNase均被释放出来，因此，需要加入抑制剂来抑制RNase活性，保护RNA。常见的RNase抑制剂如下：
①DEPC：一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。
②异硫氰酸胍：目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白体中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。
③RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：从大鼠肝或人胎盘中提取的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。
④氧钒核糖核苷复合物：由氧化钒离子和核苷形成的复合物。它和RNA酶结合形成过渡态物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。
⑤其他：SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。
3.总RNA的提取
RNA中rRNA的数量最多，而mRNA仅占1％～5％。从基因克隆、表达与基因诊断的目的出发，目前对RNA的分离与纯化主要集中在总RNA与mRNA上。总RNA的分离提取一般有两条途径：一是先提取总核酸，然后用LiCl将RNA沉淀出来；二是直接在酸性条件下用酚-氯仿混合液抽提，低pH值的酚将使RNA进入水相，使其与留在有机相中的蛋白质和DNA分开。水相中的RNA分子用异丙醇沉淀浓缩，然后复溶于异硫氰酸胍溶液中，再用异丙醇进行二次沉淀，随后用乙醇洗涤沉淀，即可去除残留的蛋白质与无机盐。常用的方法如下：
（1）异硫氰酸胍-苯酚法：也叫TRIZOL法，是一种传统的RNA提取方法，适用于大部分动植物材料，但对于次生代谢产物较多的植物材料提取RNA效果较差。异硫氰酸胍与β-巯基乙醇共同作用抑制RNase的活性，并与SDS作用使核蛋白复合体解离，将RNA释放到溶液中，采用酸性酚-氯仿混合液抽提，低pH值的酚将使RNA进入水相，而蛋白质和DNA仍留在有机相，从而可以完成RNA的提取工作。该法所提RNA纯度高，完整性好，较适合于纯化mRNA、逆转录及构建cDNA文库。
（2）胍盐-β-巯基乙醇法：适用于各种动物材料和次生代谢物少的植物材料。在这种方法中，胍盐使细胞充分裂解，β-巯基乙醇作为蛋白质的变性剂在实验全过程中可以抑制RNase的活性，保护RNA不被降解。
4.mRNA的分离与纯化
真核生物的mRNA在细胞中含量少、种类多、相对分子质量大小不一。除血红蛋白及某些组蛋白外，绝大多数mRNA在其3'末端带有一个长短不一的poly（A）尾巴。以总RNA为材料，利用碱基配对原理，通过Oligo（dT）-纤维素或poly（U）-琼脂糖凝胶亲和层析法，理论上可以分离出细胞内所有可编码的蛋白质与多肽分子的mRNA的分子群体。
（1）Oligo（dT）-纤维素柱层析法：制备mRNA的一种标准方法。它是以Oligo（dT）-纤维素填充层析柱，加入待分离的总RNA样品，其中带有poly（A）的mRNA在高盐缓冲液中，通过碱基互补，与Oligo（dT）-纤维素形成稳定的RNA-DNA杂合体，洗去未结合的其他RNA，然后在低盐缓冲液中洗脱并回收poly（A）mRNA。从哺乳动物细胞提取大量的RNA时，Oligo（dT）-纤维素柱层析法是首选方法，回收的mRNA量可达总RNA的1％～10％。但该方法分离速度慢，易阻塞，不适合于同时对多个标本的处理，而且很难回收全部的mRNA，故不适合于对含量较少的mRNA样品的分离。
（2）Oligo（dT）-纤维素液相结合离心法：为适应同时对多个标本进行处理的要求，应选用批量的层析法。Oligo（dT）-纤维素液相结合离心法不经填充层析柱，而是直接将Oligo（dT）-纤维素加入一系列的含不同RNA样品的微量离心管中，通过离心收集吸附具有poly（A）的mRNA的Oligo（dT）-纤维素，经漂洗后，用含70％的乙醇洗脱液将吸附的mRNA从Oligo（dT）-纤维素上洗脱并沉淀出来。该法可同时批量处理多个样品，而且能从少量的RNA样品中分离出具有poly（A）的mRNA。用本法分离具有poly（A）的mRNA时，应选用等级较高的Oligo（dT）-纤维素，如Oligo（dT）18～30纤维素，而一般的层析柱填充的是Oligo（dT）12～18纤维素。
（3）磁珠分离法：该技术建立于三类强有力的相互作用上，即A与T碱基间的强配对性、生物素（biotin）与链亲和素（streptavidin）间的强免疫作用，以及稀土元素磁铁与顺磁性物质间的强磁性作用。mRNA的磁珠分离技术提取mRNA的原理主要为用生物素标记的Oligo（dT）与mRNA3'端的poly（A）退火形成杂交体，然后用带有链亲和素（链菌素抗生物素）的顺磁磁珠洗涤并捕获杂交体，形成杂交体-磁珠复合体，最后用磁性分离架将此复合体捕获，这样mRNA即可与其他形式的RNA相分开，进一步用无RNase无菌水洗涤，即可获得纯化的mRNA（图4-2）。其产量甚至比常规的Oligo（dT）-纤维素柱层析法还高，且分离的带有poly（A）的mRNA能用于几乎所有的分子生物学实验。但它对组织或细胞的最大处理量每次不超过1.0 g，而且磁珠很贵，还需要专门的磁性分离架。