3.2.4　质粒DNA的复制与不相容性

3.2.4　质粒DNA的复制与不相容性

1.质粒DNA的复制

不同的天然质粒在宿主细胞内的拷贝数不同。根据质粒在宿主细胞中拷贝数的差异，可以将质粒分为两种：一种是低拷贝数质粒，每个受体细胞中仅含有1～3个拷贝，被称为“严谨型”质粒（stringent plasmid）；另一种是高拷贝数质粒，每个受体细胞中能达到10～60个拷贝，被称为“松弛型”质粒（relaxed plasmid）。特定质粒属于何种类型不仅由质粒上所携带的DNA序列决定，也和受体细胞有关。高拷贝数质粒的复制受载体编码的蛋白质调节。而低拷贝数质粒以一种严谨的方式进行复制，这种复制方式受宿主细胞内的蛋白质控制，与受体细胞染色体复制同步进行。一般相对分子质量较大的质粒属于严紧型。相对分子质量较小的质粒属于松弛型。质粒的复制有时和它们的宿主细胞有关，某些质粒在大肠杆菌内的复制属于严紧型，而在变形杆菌内则属于松弛型。

2.载体的致死效应

当利用松弛型质粒或者噬菌体载体进行高拷贝数复制时，消耗大量受体细胞的生物大分子，或者表达的目的蛋白对受体细胞有害，可以导致受体细胞死亡，此即载体诱导的受体细胞致死效应。为了避免致死效应对受体细胞的影响，可以采用温度敏感型载体。例如，表达型载体的致死效应通常是由于载体上的强启动子发挥作用时过度消耗受体细胞的氨基酸，因此可以将温度敏感型的λ噬菌体pL启动子引入载体中，利用温度敏感的pL启动子来控制目的基因的表达。在这个表达系统中，受体细胞经基因改造，在受体细胞基因组整合温度敏感的λ抑制子基因（如λclTS857），其基因产物可以抑制pL启动子活性，抑制目的基因的表达。可以在不同条件下控制目的基因的表达：

（1）目的基因非表达条件：受体细胞处于较低温度（31℃）下，cⅠ基因的表达产物抑制pL启动子活性，目的基因不表达，受体细胞携带目的基因进行扩增，可以获得大量阳性克隆菌。

（2）目的基因表达条件：受体细胞处于较高温度（42℃）下，cⅠ基因的表达产物活性被破坏，pL启动子正常工作，引导目的蛋白的大量合成。

3.质粒的不相容性

在没有选择压力的情况下，同种或亲缘关系相近的两种质粒不能同时稳定地在同一宿主细胞内共存，这种现象称为质粒不相容性（plasmid incompatibility）。当一种新质粒进入已经含有质粒的细胞时，若两种质粒含有同源复制系统，它们会相互竞争，而竞争的结果为一种质粒被逐渐消除（图3-2）。

利用相同复制系统的不同质粒同时导入同一受体细胞时，它们在复制及随后分配到子细胞的过程中彼此竞争，可能在一些细胞中一种质粒占优势，而在另一些细胞中另一种质粒占优势。当细胞生长几代后，占少数的质粒将会丢失，因而在受体细胞后代中只会保留两种质粒中的一种。其原因在于，大多数质粒会编码一种调控蛋白抑制质粒的过度复制，调控蛋白的浓度和质粒拷贝数成正比。此蛋白质参与质粒的DNA复制启动，并参与质粒拷贝数的负反馈调节过程。当细胞内质粒拷贝数增加时，调控蛋白浓度增加，从而抑制质粒过度复制。因此，如果同一受体细胞含有两种同源复制系统的不同质粒，那么每种质粒产生的调控蛋白都会抑制两种质粒的复制。伴随细胞的分裂和质粒的分离，这种交互抑制的结果会使高拷贝数质粒最终保留在细胞中，而低拷贝数质粒因无法复制而逐渐被稀释，最终失去复制的机会而被淘汰。由于这一过程需要几代或几十代甚至更长的细菌繁殖周期，而并不是一个快速的过程，因此对短期内在同一宿主细胞内导入多种质粒的实验系统，可以实现多种质粒共存。