2.4.2　T4多聚核苷酸激酶

T4多聚核苷酸激酶（T4polynucleotide kinase，PNK）是由T4噬菌体的pseT基因编码的一种蛋白质，最初也是从T4噬菌体感染的大肠杆菌细胞中分离出来的，因此称为T4多聚核苷酸激酶。目前，已用基因工程方法实现了规模化生产。

T4多聚核苷酸激酶能催化ATP上γ-磷酸转移给DNA或RNA分子的5'-OH末端，使已脱磷酸化的5'末端重新磷酸化。如果反应中使用的ATP为放射性同位素标记的［γ-32P］ATP，那么反应产物的末端将带有放射性标记。该酶作用底物是单链或双链带有5'-OH末端的DNA或RNA，不受分子链长短的限制（图2-16）。

在分子克隆中该酶呈现两种反应（图2-17）：一种是正向反应（forward reaction），将ATP的γ-磷酸基团直接转移到去磷酸化的DNA片段的5'-OH末端，即催化5'-OH末端的磷酸化，这是T4多聚核苷酸激酶的最主要功能；另一种是交换反应（exchange reaction），指在［γ-32 P］ATP和ADP过量的条件下，DNA分子的5'端磷酸基团转移给ADP，然后脱磷酸化的DNA分子从［γ-32P］ATP中获得γ-32P基团，即［γ-32P］ATP中的γ-32P同DNA片段的5'-P末端进行了交换。交换反应的底物是具5'-P末端的双链或单链DNA，它的标记效率一般说来不如正向反应，因此很少使用。

图2-16　T4多聚核苷酸激酶活性与末端标记示意图

图2-17　T4多聚核苷酸激酶的正向反应和交换反应活性

T4多聚核苷酸激酶在基因工程中主要用于对缺乏5'-P末端的DNA或合成接头进行磷酸化，同时还可标记DNA或RNA分子的5'末端，为Maxam-Gilbert化学法测序、S1核酸酶分析、制备杂交探针以及其他须使用末端标记DNA的操作提供材料。