7.2.5 蓝藻表达系统
蓝藻是一类能进行植物型光合作用的原核生物，种类众多，分布广泛，适应性强。蓝藻由于在细胞结构、代谢、遗传和进化等方面表现出独特的性质，多年来被广泛地用于研究光合作用、固氮作用、叶绿体起源以及植物进化等重大生物学问题。特别是近年来，随着基因工程的兴起和蓝藻分子生物学研究的深入，提出了蓝藻是一种独特的基因工程受体系统的观点。
1.蓝藻表达系统的特点
蓝藻是一种原核生物，是藻类中最原始的门类，兼具植物及细菌的一些特性。蓝藻作为基因工程受体系统，兼具微生物和植物的优点，因此越来越受到人们的关注。蓝藻作为外源基因表达受体，具有以下优点：①蓝藻基因组为原核型，遗传背景简单，除了裸露的染色体DNA外，不含叶绿体和线粒体DNA，便于基因分析和外源DNA检测；②蓝藻为革兰氏阴性菌，细胞壁主要由肽聚糖组成，便于外源DNA转化；③多数蓝藻含内源质粒，为利用和改造这些质粒，构建适用于蓝藻的穿梭质粒载体提供了很好的条件；④蓝藻属光合自养生长，培养条件简单，成本低，只需光、CO2、无机盐和合适的温度就能生长，适于大规模生产；⑤与常用的基因工程受体，如大肠杆菌和酵母菌相比，其细胞体积较大，能耐受高浓度（总蛋白的25％）的单一蛋白（而在E.coli中仅为5％），内源蛋白更新速度慢，对外源蛋白的容纳量较大；⑥蓝藻富含人体和动物所必需的氨基酸和生理活性物质或前体，并且多数是无毒的，是食物及药物的重要来源，若在此基础上转入有用的外源基因，可获得能生产不同用途物质的转基因蓝藻。但蓝藻作为外源基因表达受体，有时对外源基因产生强烈的排斥作用。因此，需对蓝藻受体进行改进：①降低细胞内限制性核酸内切酶的活性。藻细胞内存在多种限制性核酸内切酶，阻止了外源DNA的转入和整合。限制/修饰系统是一种自我保护机制，能防止外源DNA的侵入，这是基因转化的一个重要障碍。外源基因刚转入细胞，还未来得及整合即被内切酶降解，根本无法在细胞内稳定存在和表达。②需要良好的重组系统。外源基因要在螺旋藻中稳定存在和表达，必须整合到宿主染色体上，随它们的复制而复制，或以质粒的形式存在。蓝藻基因工程中常用的表达载体为穿梭质粒和同源重组质粒。穿梭质粒的构建需要内源质粒的复制起始序列，才能实现质粒在蓝藻细胞中的自主复制。③建立有效的筛选标记系统。基因工程常用的筛选标记有抗生素标记和营养标记，由于有些藻类对某些抗生素具有很高的抗性，因此需要寻找其他选择标记。
2.蓝藻基因转录调控机理
蓝藻基因转录调控机理目前有以下几种：①基因表达的转换与不同的σ因子有关。分离纯化的Anabaena营养细胞RNA聚合酶在体外转录系统中只能识别E.coli型启动子；Gln基因前方兼有E.coli型和nif型启动子，在营养细胞中两者可识别转录，而在除去氨氮时仅从nif型启动子转录。②存在阻遏蛋白类调节因子，在启动子下游有识别位点。Anabaena的xis A基因启动子后一段170 bp的序列，即担负阻遏其启动子在营养细胞中转录的功能，并有五核苷酸重复序列，可被一种蛋白质特异识别结合，可能为阻遏调控序列。③存在基因表达激活因子。单细胞藻Synecchococcus PCC 7942 ntcA基因突变失活则导致硝酸还原酶、亚硝酸还原酶、谷酰胺合成酶、甲基氨转移活性等氮代谢功能丧失。这种多效性表明ntcA产物可能是氮代谢基因的正调控因子。④基因组超螺旋状态调控基因的转录。氧对固氮酶基因表达的调控就可能是通过拓扑酶调节基因组超螺旋状态实现的。
转录调控是蓝藻基因调控的重要方式。recA、伴侣蛋白、铁氧还蛋白和黄素蛋白、铁调控蛋白等编码基因的转录直接受环境因子的调控。
除转录水平的调控外，也存在转录后调控。具补色适应的Calothrix 7601和Synechococcus 6701两者cpe启动子部位有一个保守识别序列，故它们在绿光条件下转录水平接近，但细胞内藻红蛋白量相差较大，可能就是转录后调控的结果。Calothrix 7601 gvp操纵子内有一个0.4 kb的反向转录本，与正向的三个转录本可互补结合，称为反义RNA。可能在结合成双链RNA后，利于特殊降解双链RNA的酶的快速作用。另外，cpc3操纵子编码的产物在翻译后N端Met被切去，则属于翻译后修饰。
3.蓝藻基因表达系统
1）蓝藻克隆载体
藻类基因工程中常用的克隆载体是穿梭质粒载体和基因整合载体，另外还有辅助质粒。
（1）穿梭质粒载体：在穿梭质粒载体系统中，带有外源基因的质粒在转化藻细胞后仍以质粒的形式在藻体中复制并表达外源基因。因此，穿梭质粒载体除了具有大肠杆菌的复制起始位点外，还必须具备能被藻体细胞识别的蓝藻质粒复制起始位点，才能实现质粒在藻体细胞中的自主复制。目前已在50余株单细胞及丝状蓝藻中发现了质粒的存在。蓝藻中所含质粒数目为1～10个不等，大小在1.3～130 kb，一般认为蓝藻质粒属隐秘型质粒，目前只在极少数淡水蓝藻中找到质粒编码功能的证据。至今尚未发现蓝藻质粒可识别的遗传标记，不能在E.coli中复制，也不能作为克隆载体。用含Tn901的E.coli质粒转化淡水蓝藻聚球藻PCC7942，由于Tn901插入蓝藻内源质粒，第一次得到带Ampr标记的杂交质粒pCH1及衍生质粒pUC1，将后者与pCYC184融合，首次获得了双向质粒pUC104和pUC105，其后，利用多种单细胞蓝藻质粒与E.coli质粒如pBR322等重组，或引入多克隆位点，或补充新的选择标记，改善载体克隆潜力，又相继构建了许多双向质粒。此外，还将cat基因重组于穿梭载体pRts 5C中，构建了鱼腥藻启动子探测质粒pHB10，可检测外源和内源启动子的表达。这种嵌有细菌遗传标记的重组质粒，由于均能在细菌和蓝藻中复制、稳定存在和表现选择标记，故被称为穿梭载体。
由于蓝藻中广泛存在限制性核酸内切酶，因此构建穿梭载体时应从质粒上选择去除相应酶切位点，用甲基化保护，或丧失位点识别能力的突变藻株作为宿主，以提高转化效率。在穿梭载体中插入报告基因，如荧光素酶基因、cat基因等，以酶的活性显示目的基因的表达和确定启动子的作用，用于基因调控和基因工程研究。
（2）基因整合载体：基因整合的方式有三种：双交换、单交换以及转座。同源部分发生双交换能造成基因置换，可用来进行定位突变研究。单交换并不造成置换，而产生部分二倍体，可用于把报告基因和目的基因融合在一起。另外，可通过转座子将选择标记随机地插入染色体DNA而产生一系列突变。
对于不具有质粒的蓝藻，利用其自身染色体片段和细菌选择标记，以实现同源重组和外源基因的整合表达，或利用病毒作为定向整合载体。目前，用于将克隆基因和染色体上的同源基因重组的载体已经被构建。这些载体缺乏蓝藻中的复制起始区，不能在蓝藻细胞中独立复制，但含有一段与宿主的染色体同源的序列、抗生素抗性的基因以及bom区（转移必需区）。在转移的过程中，同源序列之间发生单交换或双交换，将外源基因整合到宿主染色体上作为低拷贝数基因存在和表达，表达相应的抗性。这些载体通常被用于定点诱变来产生基因沉默或者用来在染色体上插入一个基因，形成局部二倍体。由于在单细胞蓝藻中很少形成重组和局部二倍体，因此整合平台对单细胞蓝藻是非常有用的。
一个携带聚球藻7942的染色体片段且具有Bam Ⅲ酶切位点的质粒作为整合靶位，融合了psbD和lac Z。在这项工作中，由于psbD基因对聚球藻7942是非常重要的，psbD的整合就非常关键。构建中间载体时将来自聚球藻7942的特定的2～4 kb的染色体插入pBR328的四环素抗性基因上。具有此整合的载体被一特定的质粒筛选，此质粒上有一个插入片段，该片段具有载体不具有的特定的限制酶切位点。
聚球藻7002的平台载体也已经建立，它使用聚球藻7002上和大肠杆菌arg3突变体互补的DNA序列，此DNA具有多个酶切位点，因此允许外源基因插入，并且可根据卡那霉素或新霉素的抗性筛选重组体。
在pBR322基础上构建的聚球藻7942整合平台，将质体蓝素基因整合到聚球藻7942上，整合平台含有pBR322的oriV区域和阿司匹林抗性基因，两者中间有卡那霉素抗性基因。此整合平台也曾将眉藻7601上的apcE基因整合到聚球藻7942上，此异源性的基因虽能表达却不能取代聚球藻7942自身的apcE基因。
（3）辅助质粒：Elhai和Wolk改造了最初的提供反式作用的mob基因的辅助质粒，他们加入了编码Ava Ⅰ甲基化酶、Eco4711甲基化酶和EcoT221甲基化酶的基因，这种辅助质粒的衍生物也常被使用。到达蓝藻中的载体在供体大肠杆菌中被甲基化。供体大肠杆菌中要有辅助质粒，用于防止被存在于许多蓝藻中的Ava Ⅰ、Ava Ⅱ和Ava Ⅲ的同裂酶酶切。在念珠藻7120中也发现有Ava Ⅰ、Ava Ⅱ和AvaⅢ活性。
2）蓝藻接合转移系统
蓝藻基因转移系统主要可分为两类：①遗传转化，包括自然转化、诱导转化、电击转化。自然转化如聚球藻PCC 7002、PCC 7942和集胞藻PCC 6803等，具有自然吸收外源DNA的能力，然而到目前为止尚不清楚自然转化的机制。诱导转化是利用溶菌酶、Ca2+诱导细胞感受态，或利用溶菌酶EDTA处理产生原生质球用于蓝藻转化。自从1989年Thiel等首次通过电击转化成功地把穿梭表达载体pRL6转入鱼腥藻M131以来，已有一批穿梭表达质粒通过电击在多种蓝藻中转化成功。②接合转移。接合转移是目前蓝藻基因转移系统中使用最为普遍的一种方法。它操作较为简单，适用于大多数的单细胞、丝状蓝藻。从Wolk首创鱼腥藻接合转移系统以来，这个系统已被修改并可应用于其他藻株，如念珠藻属、集胞藻属、聚球藻属、织线藻属等。
虽然接合转移法是蓝藻基因转化的有效系统，但需先构建含有目的基因、E.coli质粒复制起点及转移起点（oriT）和选择标记的杂交质粒，转化含有辅助质粒（有识别oriT的基因）的E.coli菌株，再通过接合引入Incp接合质粒（具有编码接合装置的基因），使三种质粒位于同一宿主，然后与受体藻株混合，通过抗生素筛选获得抗性藻落。典型的接合转移模式为三亲接合体系，该法具有普适性和高效性，在蓝藻转基因中普遍使用。该法在含抗生素的固体培养基上进行。由于使用无机培养基，大肠杆菌不会污染转化藻种。该转化系统的成功主要在于两个因素：首先是质粒载体上缺乏蓝藻细胞的限制性核酸内切酶位点，其次是蓝藻复制子能在转化的藻细胞中发挥功能。接合转移作为一种重要的蓝藻遗传转移工具，正在突变体诱导和启动子分析等方面得到越来越广泛的应用。
3）蓝藻质粒表达载体
作为蓝藻质粒表达载体，必须能转化蓝藻细胞，在其中进行有效复制，并且还必须含有能调控外源基因表达的启动子和终止子以及合适的克隆位点。
现在已有大量用于转化大肠杆菌的质粒载体，但是这些载体不能直接用于转化蓝藻。蓝藻内源质粒属于隐蔽型质粒，也不能直接作为载体用于转化蓝藻。只有构建成穿梭质粒，不仅含大肠杆菌源质粒的复制起始位点，而且含有蓝藻源质粒的复制起始位点，这样的质粒既能转化大肠杆菌，又能转化蓝藻。pPbS是构建这种穿梭质粒很好的材料。由于pPbS是一种很小的质粒，即使整个质粒作为穿梭质粒的复制起始区和复制起始位点，也只有1511 bp。选用pPbS上只有一个识别序列，并且不在复制起始区内的限制性核酸内切酶Cla Ⅰ，同时切割pPbS和大肠杆菌质粒pBR322，连接重组后获得了穿梭质粒pPRS-1（5.8 kb）。进一步以pPRS-1为出发质粒，经多次亚克隆，组装上含有CaMV 35S启动子、多克隆位点和rbcS终止子的表达盒以及Kanr基因，获得了穿梭质粒表达载体pPKE2（9.6 kb）。这是一种适用于蓝藻的强表达载体。并且由于穿梭质粒表达载体通过转化进入受体细胞后未插入染色体DNA，不会影响受体细胞的自稳系统，因此转基因蓝藻除了表达外源目的基因产物以外，一般能维持原来的性状，因此可以认为是比较安全的。其缺点是携带外源目的基因的这种质粒载体进入受体细胞后容易丢失，导致目的基因表达的不稳定性。但是可以通过选择标记药物经常筛选转基因藻株，维持其相对的稳定性。
4）藻类基因工程表达
蓝藻是藻类中唯一成功地稳定表达外源基因的类群，仅在中国就已构建了十几种转化系统，都能有效地把外源基因转入鱼腥藻7120、集胞藻6803、聚球藻7942和聚球藻7002。目前已有多个外源基因在蓝藻中表达，如大肠杆菌谷氨酸脱氢酶基因、人的SOD基因、芽孢杆菌的毒蛋白基因、脂肪酸脱饱和基因、脱氯基因、羟丁酸聚合酶基因、金属硫蛋白基因、肿瘤坏死因子基因、尿激酶原基因和人表皮生长因子基因等。这表明通过引入外源基因，赋予了蓝藻新的遗传特性，或使其成为重要的天然产物基因表达的宿主。目前还成功地将芽孢杆菌的杀虫毒素基因导入并表达于几种蓝藻细胞中，以期日后以此类基因工程藻株对水体幼蚊进行生物防治，控制疟疾。这些都标志着蓝藻基因工程正向着实用化目标迈进。外源基因在蓝藻中的表达要求克隆载体、基因转移技术以及启动子等多种因素的相互协调。如果表达产物对蓝藻有毒性以致危害其正常生长，则需对基因的表达进行调控。