6.3.7　插入失活法

插入失活法也是一种基因定位研究法，其基本原理是将特定的DNA随机插入重组DNA分子中，获得一系列插入重组子，根据其突变的类型鉴定失活的基因，进一步利用此插入DNA作为标记物，对失活基因进行定位。插入失活法主要有以下两种形式。

（1）接头插入突变：通过在重组DNA分子中随机引入序列已知的合成接头，使目的基因失活，从而确定克隆基因的位置。一般的方法是，在合适的条件下用DNaseⅠ随机切割重组DNA分子，然后，用EcoR Ⅰ甲基化酶处理线状DNA分子，钝化分子内部原有的EcoR Ⅰ识别和切割位点。再用DNA聚合酶Ⅰ将线状DNA分子的两端补平，在连接酶的作用下在此平末端接上EcoRⅠ接头，进一步用EcoRⅠ酶消化，经T4DNA连接酶作用使DNA分子重新环化，转化受体细胞后再次进行筛选鉴定。由于EcoRⅠ接头的插入可能导致克隆化目的基因的失活，因此一旦发现目的基因失活，便可通过接头插入位点，将克隆化目的基因位置确定下来。此外，也可采用识别和切割切点频繁出现的限制性核酸内切酶部分消化重组DNA分子的方法引入接头，进行插入失活基因定位。从理论上来讲，插入位点越多、越均匀，目的基因的定位越精确。但是，当待检测的外源DNA片段过长，且酶切位点分布不均匀甚至没有合适的酶切位点可用时，这种方法并不适用。

（2）转座子诱变：采用转座子（transposon）随机插入失活目的基因的方法也能进行目的基因的定位研究。与最早发现的玉米植物转座子相似，细菌中也有特定的转座子，且一般存在于某些质粒或噬菌体的基因组中，它们自身不能自主复制，但往往含有抗生素抗性基因。因此，将含有转座子的质粒或噬菌体引入克隆细胞，经过一段时间培养后，质粒或噬菌体DNA上的转座子有可能转移到待测重组DNA分子上，并且这种转座子的插入是随机发生的。从这些细胞所形成的菌落中分别制备重组质粒，然后转化合适的受体细胞，通过对重组质粒上原有表型特征和转座子抗生素抗性标记的选择，鉴定出含转座子诱变质粒的转化子。再次分离重组质粒，根据转座子和重组质粒的限制性核酸内切酶酶切图谱，确定转座子插入的位点，然后根据每个选择转化子的目的基因遗传表型表达与否，进一步定位目的基因。

上述过程中，携带转座子的质粒或噬菌体DNA转化含有待检测重组质粒的细菌细胞时，转座子既可转移在重组质粒上，也有可能直接插入细菌染色体DNA上，因而重组质粒接受转座子的能力极为有限。即使转座子能随机插入重组质粒中，也可能导致双质粒的同时存在，不利于后续操作。一种改进的方法是先通过质粒或噬菌体DNA转化的方法构建受体菌的染色体突变株，使得转座子定位在染色体DNA上的某个标记基因内。消除质粒或噬菌体DNA，然后将待测重组质粒转化这种受体菌突变株，利用重组质粒的筛选标记筛选转化子。当染色体上的转座子转移到重组质粒上时，原来被插入失活的染色体基因复原，因此利用这个标记基因的遗传表型可以筛选接受了转座子的重组子。