2.3.1　大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其应用

2.3.1　大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ及其应用

目前已经从大肠杆菌中分离纯化出三种DNA聚合酶（DNA polymerase，DNA pol），即DNA聚合酶Ⅰ、DNA聚合酶Ⅱ、DNA聚合酶Ⅲ。在这三种DNA聚合酶中，只有DNA聚合酶Ⅰ同分子克隆关系最密切。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ是1957年美国的生物化学家A.Kornberg首次从大肠杆菌中发现的，因此又称Kornberg酶。它是由大肠杆菌polA基因编码的一种单链多肽（相对分子质量约为1.09×105），具有三种酶活性。

（1）5'→3'聚合酶活性。当模板为单链DNA及引物（带3'-OH基）或5'端突出的双链DNA，利用体系中的四种脱氧核糖核苷（dNTPs），催化单核苷酸分子逐个加到3'-OH末端，形成3'，5'-磷酸二酯键，释放出焦磷酸并使链延长（图2-9）。新链合成的方向为5'→3'，与模板DNA的顺序互补。这种聚合作用需要有Mg2+存在。

（2）5'→3'外切酶活性。从5'末端降解双链DNA成单核苷酸或寡核苷酸，每次能切除多达10个核苷酸，这种酶活性在DNA损伤修复中起重要作用（图2-10）。它还可以降解DNA-RNA杂交链中的RNA链，具有RNase H酶活性。这种外切酶活性要求带切除的核酸分子具有游离的5'-磷酸基团，而且核苷酸被切除之前是已经配对的。

（3）3'→5'外切酶活性。从游离的3'-OH末端降解单链或双链DNA成单核苷酸。这种外切酶活性在体内DNA复制时主要起校对作用。当DNA复制中掺入的核苷酸与模板不互补而游离时就会被其3'→5'外切酶切除，以便重新在这个位置上聚合对应的核苷酸（图2-11）。这种校对功能保证了DNA复制的真实性，从而降低突变率。该酶切活性虽然对双链DNA也有降解作用，但是在反应体系中有四种dNTP存在，由于聚合活性占有优势，因而阻碍了对双链DNA 3'末端的降解作用。

大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ在分子克隆中的主要用途是，通过DNA切口平移，制备供核酸分子杂交用的带放射性标记的DNA探针。在DNA分子的单链缺口上，DNA聚合酶Ⅰ的5'→3'核酸外切酶活性和聚合作用可以同时发生。利用5→3外切活性DNA聚合酶Ⅰ从切口的5'端逐步水解核苷酸时，酶的聚合活性则利用切口的3'游离的羟基逐个加上相应的单核苷酸。但由于DNA聚合酶Ⅰ不能够在3'-OH和5'-P之间形成一个磷酸二酯键，因此随着反应的进行，5'一侧的核苷酸不断地被移去，3'一侧的核苷酸又按序地增补，于是缺口便沿着DNA分子合成的方向移动。这种切口移动的现象特称为切口平移（nick translation）（图2-12）。

应用切口平移法制备DNA杂交探针，其典型的反应体系是，25μL（总体积）中含有1μg纯化的特定的DNA片段，并加入适量的DNaseⅠ、DNA聚合酶Ⅰ、α-32 P-dNTPs和未标记的dNTPs。其中，DNase Ⅰ的作用在于给DNA分子造成断裂或缺口，随后DNA聚合酶Ⅰ则作用于这些单链缺口进行切口平移，使反应混合物中的32P标记的核苷酸取代原有的未标记的核苷酸，并最终形成从头至尾都被标记的DNA分子。这就是所谓的DNA分子杂交探针。

此外，大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ还可用于cDNA第二链的置换合成、3'DNA末端的标记等，但是现在一般用其他酶代替。