4.7.2　酵母单杂交系统

4.7.2　酵母单杂交系统

1.酵母单杂交的基本原理

酵母单杂交是在酵母双杂交的基础上发展起来的技术，酵母单杂交主要用于研究蛋白质和DNA的相互作用。酵母单杂交的基本原理也是基于真核生物基因的转录起始需具有DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）的转录因子参与。用于酵母单杂交系统的典型的转录因子是酵母GAL4蛋白。GAL4上的DNA结合结构域靠近羧基端，可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点（UAS），而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子TF Ⅱ D相互作用，提高RNA聚合酶的活性。在此过程中，DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。据此，可将GAL4的DNA结合结构域置换为所研究的其他蛋白质，只要它能与我们想要了解的目的基因相互作用，就照样可以通过其转录激活结构域激活RNA聚合酶，从而启动对下游报告基因的转录（图4-19）。

2.酵母单杂交技术的特点

采用酵母单杂交系统能在一个实验过程中识别与DNA特异性结合的蛋白质，同时可直接从基因文库中找到编码蛋白的DNA序列而无须分离纯化蛋白质，实验简单易行。由于酵母单杂交体系检测到的与DNA结合的蛋白质处于自然构象，克服了体外研究时蛋白质通常处于非自然构象的缺点，因而该方法具有很高的灵敏度。目前，多种酵母单杂交体系的试剂盒和相应的cDNA文库已经商品化，为酵母单杂交系统的使用提供了有利的条件。

但酵母单杂交也存在以下缺点。有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录，因此往往产生假阳性结果。如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性，融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达，融合蛋白发生错误折叠或不能定位于酵母细胞核内，或者融合的GAL4-AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点，则都可能干扰AD融合蛋白结合于靶基因的能力，从而产生假阴性结果。

3.酵母单杂交系统的基本操作过程

（1）设计含目的基因（称为诱饵）和下游报告基因的质粒并将其转入酵母细胞。

（2）将文库蛋白的编码基因片段与GAL4转录激活域融合表达的cDNA文库质粒转化至同一酵母中。

（3）若文库蛋白与目的基因相互作用，可通过报告基因的表达将文库蛋白的编码基因筛选出来。在这里作为诱饵的目的基因就是启动子DNA片段，文库基因所编码的蛋白质就是启动子基因结合蛋白。

4.酵母单杂交技术的用途

迄今为止，应用酵母单杂交系统已经识别并验证了许多与目的DNA序列结合的蛋白质，同时单杂交技术还被应用于识别金属反应结合因子。正向与反向单杂交系统的结合，还可用于筛选阻碍DNA与蛋白质相互作用的突变的单个核苷酸。目前，在研究DNA与蛋白质相互作用时，酵母单杂交系统主要有以下用途：①确定已知核苷酸序列与蛋白质之间是否存在相互作用；②分离结合于顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因；③定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域，准确定位与DNA结合的核苷酸序列。