9.4.2 外源基因整合及其整合拷贝数的鉴定
1.报告基因
报告基因(reporter gene)是指其编码产物能够被快速测定,常用来判断外源基因是否已经成功地导入宿主细胞(器官或组织)并检测其表达活性的一类特殊用途的基因。对于一个理想的报告基因,最基本的要求是在转化的宿主细胞中不存在相应的内源等位基因的活性,其表达产物不仅不会损害宿主细胞,而且具有快速、灵敏、定量和可重复的检测特性。通过分析报告基因的表达产物mRNA和蛋白质,便可检测出在转基因植株中报告基因的活性。在转基因植物的实验设计中,是将报告基因的编码区与位于其上游的目的基因融合,并置于目的基因启动子的控制之下。可见报告基因实质上起到判断目的基因是否表达的标记基因的作用,常用的报告基因有β-葡萄糖苷酸酶(β-glucuronidase,GUS)基因、绿色荧光蛋白(green-fluorescent protein,GFP)基因、荧光素酶(luciferase,LUC)基因、氯霉素乙酰转移酶(chloramphenicol acetyltransferase,CAT)基因(见3.2.3小节)。
2.转基因植株的PCR检测
转基因植株的PCR检测是根据外源基因序列设计特异性引物,通过PCR特异性地从转化植株基因组中扩增出外源片段,从而筛选出阳性转基因植株的方法。PCR检测所需DNA量少、纯度要求低、操作简单、检测灵敏、效率高、成本低,能够从大量的转化样品中快速筛选出阳性植株,是目前在转基因检测中广泛使用的方法。但引物设计不合理、靶序列或扩增产物的交叉污染等因素可能造成假阳性结果的出现,同时由于DNA插入受体细胞基因组后发生的重排等致畸因素,也会增加阳性转基因植株漏检的可能性,因此普通PCR的检测结果通常仅作为转基因植物初选的依据,还需要进一步进行其他如Southern印迹法、Western印迹法等相关鉴定。
在同一PCR环境内对内源基因与外源基因进行扩增,扩增产物在琼脂糖凝胶电泳上进行分离,分析目的条带灰度,可以检测外源基因的拷贝情况。
3.Southern印迹杂交
Southern印迹法原理见4.3节,该技术在外源基因整合鉴定中被认为是筛选阳性转基因植株最为可靠、稳定的方法。用标记的目的基因片段作为探针与消化的待测的基因组DNA进行杂交,包含目的基因的基因组片段因为与探针具有同源性而显示出杂交信号,通过检测信号的有无、强弱、杂交条带的类型可以实现定性、定量分析,从而实现外源基因整合及拷贝的分析。如图9-18所示,选择目的基因内部有酶切位点的限制性核酸内切酶如EcoR Ⅰ,对转基因植物的基因组DNA进行酶切,以目的基因的一段为探针,要求探针序列位于目的基因的一端,并且不能包括酶切位点,进行Southern印迹杂交。如果是单拷贝的插入,杂交结果应显示一个未知长度的条带,长度的大小取决于基因组上下一个酶切位点的位置。如果是多拷贝的串联整合,结果应显示一个目的基因长度的条带和一个未知长度的条带。

图9-18 Southern印迹法检测插入基因拷贝数
4.PCR-Southern
PCR-Southern是近年来开始使用的检测外源基因整合的方法。该方法先对被检材料进行PCR扩增,然后用目的基因的同源探针与扩增的特异性条带进行杂交。由于Southern印迹杂交对样品DNA纯度要求很高,未经纯化的样品杂交效果不理想,虽然Southern印迹杂交灵敏度很高,理论上可检测出1 pg单拷贝的外源基因,但实际操作中往往达不到此检出量。另外,Southern印迹杂交需要的样品量较大(5~15 μg DNA),转化材料较少时不能及时检测。而PCR-Southern恰好可弥补上述缺点。因此,该方法常用于检测转基因植物中外源基因及分析外源基因的遗传稳定性和遗传规律。
5.实时荧光定量PCR
利用新型、灵敏、高通量的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)技术可以测定原始品系中转基因的绝对拷贝数。实时荧光定量PCR技术是一种较新的DNA定量方法。其原理是在PCR反应体系中加入非特异性的荧光染料(如SYBR GREEN Ⅰ)或特异性的荧光探针(如Taqman探针),实时检测荧光量的变化,获得不同样品达到一定的荧光信号(阈值)时所需的循环次数——CT(cycle threshold)值;将已知浓度标准品的CT值与其浓度的对数绘制标准曲线,就可以准确定量样品的浓度。实时荧光定量PCR技术具有简便、快捷的优点,能够有效扩增低拷贝的靶片段DNA,对每克样品中20 pg~10 ng的转基因成分进行有效检测。同时,与Southern印迹法相比,实时荧光定量PCR技术可对T-DNA的不同序列进行扩增,因此能实现对品系中的基因重组的检测,目前已广泛用于定量检测基因拷贝数和基因表达。用植物体中已知拷贝数的基因为内参,利用内参基因CT值与初始拷贝数的线性关系计算外源基因插入拷贝数。
6.染色体原位杂交
染色体原位杂交(insitu hybridization)是检测外源基因在染色体上确切整合位置的重要手段。其原理是利用碱基互补原则,将经同位素或荧光标记的DNA片段作为探针,与染色体标本上的基因组DNA在原位进行杂交,经放射自显影或荧光激发等检测手段在显微镜下直接观察并分析目的基因在染色体上的整合位置。原位杂交分析结果的好坏,较大程度取决于染色体标本的质量。较好的染色体标本应该分散良好,有较多的核型完整分裂象。随着荧光显微镜技术的发展和计算机图像处理系统的应用,原位杂交的分辨率已有了很大的提高。
7.基因芯片
基因芯片(gene chip)是在已发展的核酸杂交技术基础上开发的一项新技术。其原理是将已知序列的基因探针固定在固相支持物表面,通过与标记的DNA样品杂交,检测相应位置杂交探针,从中获取信息并经计算机处理分析得到结果,根据检测信号的有无或强弱,确定待测样品中该基因的有无或核苷酸序列的含量。