3.7.4　细菌人工染色体载体

细菌人工染色体（bacterial artificial chromosome，BAC）是一种以大肠杆菌F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，其承载外源DNA片段的能力通常在150 kb左右，最多可承载300 kb外源DNA片段。BAC载体克服了YAC载体的多种缺点。BAC重组体在一个细菌细胞中只有1～2个拷贝，稳定性好，嵌合体比例低，转化效率高，而且以环状结构存在于细菌细胞内，易于分辨和分离纯化。BAC载体包含6个重要的功能区域，即氯霉素抗性标记（Cmlr）、一个严谨型复制子ori S、解旋酶repE，以及三个确保低拷贝数质粒精确分配至子代细胞的基因座（parA、par B和par C）。其中repE是一个由ATP驱动的可促进DNA复制的蛋白酶。通常，BAC重组体在大肠杆菌宿主细胞内以单拷贝形式存在。

常用的BAC载体pBeloBAC11结构如图3-31所示，空载时大小约7507 kb。此载体上单独出现一次的酶切位点为BamH Ⅰ、Hind Ⅲ和Xho Ⅰ。在大肠杆菌中以质粒形式存在和复制，外源基因组DNA片段可以通过酶切、外源DNA连接到BAC载体BamH Ⅰ、Hind Ⅲ或Xho Ⅰ三个克隆位点，通过电穿孔方法将连接产物导入大肠杆菌重组缺陷型菌株，转化效率比转化酵母细胞高10～100倍。转化后宿主细胞通过氯霉素抗性基因（Cmlr）筛选宿主细胞转化菌，并利用β-半乳糖苷酶α片段基因（lac Z'）的蓝白斑筛选插入BamH Ⅰ或Hind Ⅲ位点的重组质粒。目前，BAC主要用于大片段基因组文库的构建、基因组测序、文库筛选和转基因研究。

图3-31　细菌人工染色体载体pBeloBAC11结构