2.4.1　末端脱氧核苷酸转移酶

末端脱氧核苷酸转移酶（terminal deoxynucleotidyl transferase，TdT），简称末端转移酶（terminal transferase），于1960年从小牛胸腺前淋巴细胞及分化早期的类淋巴样细胞中分离得到。该酶在二甲胂酸缓冲液中，能够催化5'-脱氧核苷三磷酸进行5'→3'方向的聚合作用，逐个地将脱氧核苷酸分子加到线状DNA分子的3'-OH末端（可加数百个）。反应合成的方向是从底物的5'端向3'端方向进行，合成时不需要模板，是一种不依赖模板的DNA聚合酶。但是底物要有一定长度，至少有3个核苷酸。反应底物可以是带有3'-OH末端的单链DNA，也可以是有3'端伸出的双链DNA。反应时要有二价阳离子参与，如果反应底物为dATP或dGTP，二价阳离子首选Mg2+；如果反应底物为dTTP或dCTP，二价阳离子首选Co2+。四种dNTPs中的任何一种都可以作为合成反应的前体物，当反应混合物中只有一种dNTP时，就可以形成仅由一种核苷酸组成的3'尾巴。特称这种尾巴为同聚物尾巴（homopolymeric tail）（图2-13）。

图2-13　末端转移酶的活性

末端转移酶在基因克隆中的用途如下：

（1）应用同聚物加尾克隆DNA片段。在合成cDNA反应中，为了将cDNA与质粒载体连接，利用末端转移酶在质粒载体的3'末端加接（GGGG）n，而在cDNA的平末端加接（CCCC）n，退火反应后两者进行连接，合成带有DNA片段的重组质粒（图2-14）。

图2-14　DNA片段末端加同聚物尾巴连接重组

（2）应用适当的dNTP加尾，再产生供外源DNA片段插入的有用的限制位点。如用poly（dT）加尾法产生Hind Ⅲ识别位点（图2-15）。

图2-15　用同聚物加尾法再生出HindⅢ限制位点

（3）用于DNA片段的3'末端标记。反应底物为32 P标记的dNTP，在末端转移酶的作用下对DNA片段3'末端进行放射性同位素标记；如果底物为生物素或荧光素等非放射性标记的核苷酸，同样也可使DNA片段3'末端掺入非放射性标记。

（4）按照模板合成多聚核苷同聚物。