6.3.9　转录产物作图

如果克隆DNA片段中的目的基因能够转录生成mRNA产物，通过对mRNA的分析，也可以间接鉴定重组DNA分子，并对目的基因进行定位研究。具体方法有以下两种。

1.S1酶作图法

S1酶作图法由Berk和Sarp于1977年建立，主要依据与R环检测法相同，即在高浓度的甲酰胺溶液中，DNA-RNA双链分子比DNA-DNA双链稳定。其基本做法如下：经热变性处理的DNA分子在高浓度的甲酰胺溶液中与同一材料的mRNA复性杂交，由于mRNA是由克隆DNA片段中目的基因的外显子区域转录生成的，两者能形成上述R环结构。用单链特异的S1核酸酶消化R环结构中处于单链状态的DNA分子，保留了杂合的双链分子。然后分别在自然条件和变性条件下进行琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳。在自然条件下进行的凝胶电泳中，杂合双链区形成一条带，由此可确定不被降解的DNA片段的大小。而在变性条件（碱性条件）下进行凝胶电泳时，由于mRNA分子被水解，每个DNA分子都有其特定条带。用目的基因上不同区段的DNA进行杂交，即可确定mRNA的末端及位于该基因内部的内含子的位置。

2.引物延伸作图法

引物延伸作图法可用于RNA 5'端的定位和定量。利用5'端标记的单链DNA引物（合成的寡核苷酸或限制性核酸内切酶酶切片段）与mRNA杂交，在逆转录酶的作用下合成与mRNA互补的cDNA，再通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳测定cDNA的长度，即可反映出引物末端标记核苷酸与RNA 5'端的距离，而cDNA的量与mRNA样品中靶序列的浓度大致成正比。