8.1 真核表达系统的特点
原核表达系统虽然具有高效、廉价的优点,但外源蛋白通常以包含体形式存在,表达产物活性较低甚至不具有活性,使得真核表达系统越来越受到重视。在表达真核蛋白时,由于原核细胞缺少翻译后加工修饰所需要的酶和相关机制,加上原核表达系统的胞内环境中还原性因素所限,真核蛋白在原核细胞中表达以后不能形成精确的二硫键,此外糖基化、磷酸化、寡聚体的组装,以及其他翻译后的加工过程也会受到影响而不能顺利进行,使得表达的真核蛋白不能正确折叠,无法形成有生物活性的构象,生物活性会大大降低,甚至丧失。因此在进行外源基因表达时,要根据具体情况选择好受体细胞和表达系统。如果存在蛋白质翻译后加工的问题,选择真核表达系统是更为明智的策略。有的情况下,即使选择的基因表达系统能够进行糖基化,也不一定符合要求,因为不同真核生物的糖基化机制有一定的差别,这种糖基化的差异往往影响到蛋白质类药物的疗效。比如,当重组蛋白的糖基化程度同天然人源蛋白质相差较大时,人体就会将其视为异体蛋白,引起免疫排斥反应。在大肠杆菌或酵母中表达的缺少糖基化或糖基化程度不足的重组蛋白,可能由于多肽的抗原决定簇暴露而使人体产生与其相对应的抗体,影响重组蛋白在临床上的应用。翻译后加工的问题在基因工程产品的生产中越来越受到人们的重视,而随着这一问题的解决,将不断提高基因工程产品的效率和安全性。
真核表达系统主要包括哺乳动物和酵母细胞,最常见的哺乳动物细胞系是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。1985年Lin等用几种合成的寡核苷酸探针从Charon 4A人胎肝基因组文库中克隆了EPO基因,并在CHO细胞中获得了高效表达。以后EPO陆续在大肠杆菌、酵母、幼仓鼠肾细胞(BHK)和昆虫细胞中进行了表达。但原核细胞没有糖基化修饰的功能,其表达的EPO在体内无活性。而在酵母和昆虫细胞进行表达的EPO,虽然有糖基化,但与哺乳动物的糖基化有所不同,糖基中缺少唾液酸,在体内也无活性。因此,目前国内外都是用CHO或BHK细胞进行生产的,其表达水平一般为(5~15)×10-6μg/d。
甲型血友病是由缺乏凝血因子FⅧ引起的,因此FⅧ是治疗该病必不可少的药物。1984年Wood和Toole等先后对FⅧ基因进行了克隆,由于FⅧ是一种大分子的糖蛋白,因此采用基因工程生产该蛋白质的宿主细胞主要是哺乳动物细胞。目前已经有两种重组FⅧ产品获得批准,分别是CHO细胞表达生产的商品Recombinate和BHK细胞表达生产的商品Kogenate。