8.4.4 提高哺乳动物表达系统表达效率的途径
将外源基因导入哺乳动物细胞之后，获得高效的基因表达是研究者的主要目标，认真分析各种因素，达到最佳的条件是提高基因表达效率的有效途径。在细胞表达外源基因时存在表达水平低及获得高表达细胞株的时间长等困难。目前主要通过增加目的基因的拷贝数，优化目的基因在宿主细胞染色体上的整合位点，以及提高转录水平和翻译水平等手段来构建和优化哺乳动物细胞的高效表达系统。
（1）选择宿主细胞。要获得外源基因的高效表达，首先需要选择合适的宿主细胞。一般是选择已经丧失接触抑制和锚定依赖性的细胞系，便于大规模培养。遗传稳定性好、周期短易于培养的细胞更为理想，此外，细胞的安全性以及选择标记也是重要的因素。如猴肾细胞（COS）、犬肾内皮细胞（MDCK）、CHO细胞以及BHK/v16细胞等。
（2）改进表达载体，提高表达水平和产量。作为表达载体，强启动子可以增加转录活性。细胞内源性强启动子如鼠H2-Kb启动子、鼠pgK-1启动子、鸡胞浆β-肌动蛋白启动子等可以用于构建表达载体。外源基因表达产物对细胞有毒时可采取诱导表达，可以避免表达产物对细胞的不利影响。诱导型的启动子，如热休克蛋白启动子、重金属启动子、糖皮质激素启动子等已用于构建诱导型载体，但这些系统的诱导表达特异性差，常对细胞造成损害。而四环素的Tet-on基因表达系统特异性较强，只有加入四环素或强力毒素后目的基因才会高效表达，该系统是目前应用最广的哺乳动物细胞诱导表达系统。此外，利用增强子也可提高基因表达效率，目前使用的增强子有人巨细胞病毒（CMV）增强子和Rous肉瘤病毒基因长末端重复序列（LTR）。如真核表达载体pCAGGS的启动子就是鸡胞浆β-肌动蛋白启动子与CMV启动子的增强子元件组合在一起构建成的杂合启动子，其转录活性是CMV启动子的1.5倍，比CMV启动子的应用范围更广。有些内含子对基因表达具有调控作用，为了稳定基因表达，可将内含子序列构建在表达载体中。此外，mRNA的稳定性也会影响蛋白质产物的形成，在目的基因3'端加上poly（A）信号，可使表达水平提高10倍以上。目前表达载体的商品化生产已经初具规模，研究人员可以通过各大公司的网站进行载体的查询及购买，极大缩短了构建载体所需要的时间。在新冠病毒疫情期间，很多生物公司提供免费的已经搭载完病毒相关蛋白的表达载体，供科研人员使用，希望能够尽快开发出有效抑制新型冠状病毒的研究方案，这也是我国生物科技进步的体现。
（3）构建多顺反子。绝大多数哺乳动物表达载体只带有一个编码功能肽的目的基因。但一些商业上重要的蛋白质的活性形式往往由两条不同的蛋白链组成。在体外多肽链几乎不能正确装配，而在体内装配二聚体和四聚体效率很高。通过构建多顺反子的表达载体，利用内核糖体进入位点（internal ribosome entry Site，IRES）介导进行翻译，可以获得持久、稳定表达的外源基因产物。双顺反子载体将两个基因用IRES隔开，形成“基因-IRES-基因”的结构，在“双基因”转录物形成之后，翻译就从mRNA 5'末端开始形成第一条链（α链），而后从IRES处开始翻译产生另一条链（β链）。
（4）强化基因扩增，高效表达外源蛋白。利用甲氨蝶呤对细胞的毒性来选择二氢叶酸还原酶基因（dhfr）扩增的细胞，与dhfr相邻近的外源基因被同时扩增，利用该方法可使每个细胞的外源基因拷贝数达到100个左右，使表达产物大大增加。另外，谷氨酰胺合成酶（GS）-甲硫氨酸亚砜（MSX）表达系统也用于提高外源基因拷贝数，增加基因表达产物量。CHO-dhfr扩增系统可使目的基因拷贝数扩增至1000倍。Werner等在neo基因的内部人工内含子中放置目的基因和dhfr基因偶联的表达单元，通过用MTX对阳性克隆的dhfr扩增，CD20单克隆抗体的表达量高达2 g/L。
（5）利用代谢工程改善培养工艺，降低成本。通过引入特定的代谢途径，使细胞对培养基的要求降低，可以大规模培养。如可以用无血清培养基进行培养，降低生产成本。在工业化大规模细胞培养中常采用的无血清/无蛋白培养基（SFM/PFM）缺乏生长刺激因子、黏附因子、扩展因子以及其他细胞生长存活所必需的成分，通过将生长刺激因子、黏附因子基因导入CHO细胞中，能使细胞在SFM/PFM中生长良好。降低成本的另一种方法是优化培养工艺，如采用灌流式生物反应器（BiofermentorTM），通过透析膜补充缺乏的营养成分，通过微硅胶管补充溶解氧。
（6）抑制细胞凋亡，延长细胞周期。细胞凋亡是细胞正常的生理特征，但在生物反应器中的细胞死亡受培养条件影响，通过改变培养条件可以抑制细胞凋亡、延长细胞周期，提高外源基因表达效率。如使营养和氧源充分，加入抗氧化剂延缓细胞凋亡以及引入抗凋亡基因等。Chen等在杂交瘤细胞中虽然仅敲除了一条乳酸脱氢酶（LDH）基因2A等位基因，乳酸产量减少，细胞的培养周期大为延长，单克隆抗体的产量大为增加。利用GS基因扩增系统的宿主细胞必须利用氨合成谷氨酰胺，因此GS基因扩增系统可使细胞中氨量大大减少。GS-MSX系统应用于骨髓瘤细胞，氨减少后抗体产量也显著提高。提高BCL-2的表达水平同时降低caspase-3的表达水平，明显地提高了细胞的抗凋亡能力。
（7）通过糖基化工程提高产品质量。哺乳动物蛋白的一个重要特征是糖基化，而糖基化的方式决定蛋白质的特征。特别是N-糖基化对蛋白质的特性起主要作用。细胞内糖基化酶以及培养环境等对蛋白质的糖基化有一定影响，因此要选择合适的宿主细胞，使其表达的蛋白质尽可能与人类天然蛋白的糖基化相同或相似。另一方面，要通过基因工程方法改造宿主系统，引入糖基化酶以增强其糖基化能力。此外，优化培养条件也有利于表达蛋白的糖基化。