8.2.3 酵母表达系统宿主菌
酵母作为一种真核表达系统，不仅具有原核生物的一些优点，如操作简便、生长快速、易于培养和进行大规模发酵生产，而且表达产物可进行相对正确的折叠和翻译后加工修饰，特别是蛋白质的糖基化修饰等对于保证重组蛋白质量十分重要。由于酵母表达系统具有这些优点，近几年来，工程化的甲醇酵母（Hansenula、Pichia、Candida和Torulopsis）、酿酒酵母等几种酵母已经被用于外源蛋白的商业化生产。
1.毕赤酵母
毕赤酵母（Pichia pastoris）是20世纪70年代Koichi Ogata发现的一种可利用甲醇作为唯一的能源和碳源生长的甲醇酵母。甲醇代谢的第一步是甲醇在乙醇氧化酶作用下被氧化成甲醛，乙醇氧化酶对氧的亲和力很弱，因此甲醇酵母代偿性地大量产生这种酶。调控乙醇氧化酶的启动子是强启动子，可用于调控异源蛋白的表达。毕赤酵母表达系统是利用甲醇的独特优势使其成为一个表达外源基因很成功的表达系统，甲醇酵母被认为是分泌表达或非分泌表达外源基因的一种优秀工程菌。
由于甲醇能够从天然气中获得，价格低廉，因此毕赤酵母曾被用于生产单细胞蛋白（single cell protein，SCP），有很好的发酵基础，菌体（干细胞）质量体积浓度可达130 g/L以上。在毕赤酵母中有两个编码甲醇代谢途径的关键酶——乙醇氧化酶（alcohol oxidase，AOX）的基因，AOX1基因受甲醇诱导和调控，AOX2基因与AOX1基因有很高的同源性，其蛋白质产物有97％的氨基酸残基相同。在AOX基因进行高效表达时，其产量可达细胞可溶性蛋白的30％。由于AOX基因具有甲醇特异性诱导的启动子，在其他碳源如葡萄糖、甘油或乙醇培养的细胞中，AOX不会表达。AOX基因的启动子具有明显的调控功能，可在转录水平上调控外源基因的表达，此调控作用可以通过培养基中是否添加甲醇来实现，是由一般碳源抑制（或解除抑制）及碳源特殊诱导机制控制的。外源基因在甲醇以外的碳源中处于非表达状态，而在培养液中加入甲醇后，外源基因即被诱导表达，因此毕赤酵母是甲醇诱导性的表达系统。目前，毕赤酵母宿主菌株主要有Y-11430、GS115（his4）、KM71（aox1Δ：：SARG4 his4 arg4）、MC100-3（aox 1A：：SARG4 his4 arg4 aox2Δ：：Phis4 his4 arg4）、SMD1168（pep4Δhis4）、SMD1163（pep4 prbl his4）等。Y-11430为野生型，其余皆为组氨酸突变型。GS115有完整的AOX1基因，转化子表型为Mut+或Muts，可以用MD和MM鉴定转化子。KM71没有AOX1基因，而是被ARG4基因替代，只有依靠AOX2基因在甲醇培养基上生长，其转化子为Muts。SMD1168为蛋白酶缺陷型菌株，可避免细胞高密度培养过程中蛋白水解酶对外源蛋白的降解，特别适合于分泌表达载体。毕赤酵母在异源蛋白的分泌表达方面优于酿酒酵母，获得重组蛋白高效表达的关键因素是整合型表达基因的多拷贝存在。目前已有300种异源蛋白在毕赤酵母中进行了表达。
构建毕赤酵母表达菌株的基本方法是先构建穿梭载体，然后转化宿主酵母菌细胞。转化的方法包括原生质体法、LiCl转化法、PEG转化法及电转化法，其中原生质体法及电转化法效率高，但是有些载体系统不适用原生质体法转化，如pPIC系列及pGAP系列。
哺乳动物细胞中天然存在的蛋白质多数是糖蛋白，其糖基化的类型和位点与蛋白质的生物活性和组织靶向性有密切关系，而酵母的糖基化方式和位点与哺乳动物细胞有所不同，限制了酵母表达系统的应用，目前酵母表达系统主要用于表达非糖蛋白。将毕赤酵母糖基化改造成类似于哺乳动物糖基化是毕赤酵母表达系统近年来研究的热点和难点。
2.酿酒酵母
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）很早就被应用于食品工业，是最早应用于酵母基因克隆和表达的宿主菌，也是目前为止了解最完全的真核生物，1996年完成了其基因组全序列测序工作。酿酒酵母表达系统表达外源基因具有如下优点：一是具有安全性，人类对酿酒酵母的利用有相当长的历史，长期应用于食品工业的酿酒酵母是安全性很高的生物，美国FDA已经认定其安全性；二是容易进行培养，生产工艺简单；三是具有翻译后加工的特点；四是可以分泌表达外源蛋白，容易纯化；五是研究背景清楚，易进行操作。克隆的基因通常用GAL启动子来控制，该启动子位于半乳糖差相异构酶（galactose epimerase）基因的上游，并受半乳糖的诱导。葡萄糖对GAL启动子有强烈抑制作用，只有当葡萄糖完全耗尽后，半乳糖才能诱导GAL启动子表达外源基因。其他的启动子还有PHO5和CUP1，分别受培养基中的磷酸和铜的调节。酿酒酵母表达系统的缺点包括发酵时产生乙醇，影响外源基因的高水平表达；缺乏强启动子；蛋白质过度糖基化引起副反应；表达菌株不稳定，质粒易丢失；分泌效率低。
酵母表达外源蛋白时，可以是胞内的，也可以是分泌到胞外的，分泌到胞外对外源蛋白本身而言更为稳定，产量也较胞内形式更高，因此多选择具有信号肽的分泌型表达菌株。但是信号肽具有选择性，所以选择合适的信号肽对于提高某种重组蛋白的表达量是非常重要的，常用的信号肽有α-MF、PHO5、SUC2等。在酿酒酵母中，通常只有分泌蛋白才能糖基化。酵母的交配因子α（mating factor a，α-MF）的前导序列必须接到目的基因上游，融合基因可有效分泌酵母产生的外源蛋白，并可形成正确的二硫键，切除前导肽并进行翻译后修饰。
1981年Hitzeman等在酿酒酵母中成功表达出人重组干扰素，为酿酒酵母表达系统应用于多种外源基因表达奠定了基础。目前美国FDA批准的多种药物如乙肝疫苗、细胞因子、多肽激素、酶、血浆蛋白等都已经用酿酒酵母进行生产。
3.乳酸克鲁维亚酵母
乳酸克鲁维亚酵母（Kluyveromyces lactis）长期用于发酵生产β-半乳糖苷酶，其遗传学背景研究得比较深入，也是安全性很高的微生物，已被证明可利用其天然启动子高水平表达外源基因。目前乳酸克鲁维亚酵母应用最多是β-半乳糖苷酶基因（lac4）的启动子。乳酸可以作为乳酸克鲁维亚酵母的能源和碳源，并诱导lac4基因表达生成半乳糖苷酶使乳糖分解。lac4基因的启动子已经分离出来，用于构建外源基因表达载体。果蝇乳酸克鲁维亚酵母的双链环状质粒pKD1已用于构建高效表达载体，采用URA3基因或Kanr的Tn90基因来建立表达载体，其拷贝数可达70，可诱导性强。
乳酸克鲁维亚酵母的主要优点如下：适合于高密度发酵；不产生甲醇；繁殖能力强，适合于工业化生产。此外，以乳酸克鲁维亚酵母表达分泌型和非分泌型的重组异源蛋白，均优于酿酒酵母，而且重组蛋白能正确折叠。因此，乳酸克鲁维亚酵母表达系统在分泌表达高等哺乳动物来源的蛋白质方面具有较好的应用前景。
4.产朊假丝酵母
产朊假丝酵母（Candidautilis）在工业上用于生产谷胱甘肽以及氨基酸和酶类，也是一种安全的微生物。在许多国家，产朊假丝酵母用作饲料。该酵母具有一些优点，如在严格好氧条件下不会产生乙醇，适合高密度发酵，可以用糖蜜来培养。
产朊假丝酵母没有稳定的质粒，外源基因需要整合到染色体上进行表达。其rDNA序列和URA3基因已经分离成功，可作为整合介导区整合到染色体上，用于控制有外源基因表达载体与宿主染色体之间发生同源重组的位置，形成多个拷贝。
5.裂殖酵母
裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）是一类以分裂和产孢子的方式进行繁殖的酵母。与其他酵母相比，它更接近真核生物，如具有线粒体结构、启动子结构，转录机制和对蛋白质N端乙酰化功能均更接近于哺乳类细胞，因而逐渐成为研究真核生物分子生物学的模式生物。它作为外源基因表达系统也逐渐受到人们关注。
裂殖酵母有近一半的基因具有内含子，其3'端剪切位点与高等生物相似，均为CTNAC，可以作为良好的高等真核生物基因表达系统。由于该系统表达的外源蛋白更接近其天然形式，因此已经用于多种蛋白质的表达，如人凝血因子Ⅷa、人白介素6（IL-6）等。
6.汉逊酵母
汉逊酵母也是一种甲醇酵母，ura3和leu2缺陷型菌株已经分离出来，其两个自主复制序列HARS1和HAR2也已经被克隆，但与乳酸克鲁维亚酵母和毕赤酵母相似，由HARS构建的自主复制型质粒在受体细胞有丝分裂时显示出不稳定性。但其质粒整合频率很高，在宿主基因组上可达100多个拷贝，因此重组汉逊酵母的构建可以采用整合策略。目前，已经有10多种外源蛋白在汉逊酵母表达系统中获得表达。