4.5.2 Maxam-Gilbert化学降解法
1.Maxam-Gilbert化学降解法测序原理
一个末端标记的DNA片段在几组互相独立的化学反应分别得到部分降解，其中每一组降解反应特异地针对某一种或某一类碱基。因此生成一系列长度不等的放射性标记分子，从共同起点（放射性标记末端）延续到发生化学降解的位点。每组混合物中均含有长短不一的DNA分子，其长度取决于该组反应所针对的碱基在原DNA全片段上的位置。此后，各组均通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，再通过放射自显影来检测末端标记的分子。该方法测定DNA序列长度一般不超过250 bp。其原理如图4-16所示。
2.碱基特异性化学切割反应
在化学降解法中，专门用来对核苷酸进行化学修饰并打开碱基环的化学试剂主要有硫酸二甲酯（dimethylsulphate，DMS）、哌啶（piperidine）和肼（hydrazine）。硫酸二甲酯可使DNA分子中鸟嘌呤（G）上的N（7）原子甲基化；肼可使DNA分子中胸腺嘧啶（T）和胞嘧啶（C）的嘧啶环断裂，但在高盐条件下，只C断裂，而不与T反应；哌啶可从修饰甲基处断裂核苷酸链。在不同的酸、碱、高盐和低盐条件下，三种化学试剂按不同组合可以特异地切割核苷酸序列中特定的碱基。
（1）G反应：DMS使G在中性和高温条件下脱落。
（2）G+A反应：在酸性条件（如甲酸）使A和G嘌呤环上的N原子质子化，利用哌啶使A、G脱落。
（3）T+C反应：肼（低盐）在嘧啶残基上的裂解。
（4）C反应：肼（高盐）在C残基上的裂解。
图4-15 Sanger双脱氧链终止法测序原理
图4-16 Maxam-Gilbert化学降解法测序原理
3.测序电泳图谱的识读
对于测序电泳图谱的识读，化学降解法要比末端终止法复杂，因为化学裂解反应并非是完全碱基特异的。需要通过从C+T泳道出现的条带中扣除C泳道的条带而推断T残基的存在。类似地，A残基的位置也要通过从A+G泳道中扣除G泳道的条带推断出来。
实际读片时从胶片底部向顶部一个个地读取。从下至上，一个一个地从G+A泳道和C+T泳道两个列中确定只相差一个碱基的条带。如果在G+A泳道中出现一条带，就看G泳道中是否有相同大小的带，如果有即为G碱基，如果没有则为A碱基。同样，在C+T泳道中出现条带，就检查C泳道中有无同样大小的条带，如果有即为C，无则为T。