6.1.1 原核受体细胞简介
原核生物细胞可作为较为理想的受体细胞,其主要原因是大部分原核生物细胞的细胞壁没有纤维素,便于外源DNA的导入。没有核膜,染色体DNA没有固定结合的蛋白质,便于外源DNA与染色体DNA进行重组。原核细胞基因组结构简单,不含线粒体和质体基因组,便于对引入的外源基因进行遗传分析。原核生物多数为单细胞生物,容易获得一致性的实验材料,并且培养简单,繁殖迅速,实验周期短,重复实验快。因此,原核生物细胞普遍作为受体细胞用来构建基因组文库、cDNA文库,建立生产目的基因产物的工程菌或者作为克隆载体的宿主菌。用作受体菌的原核生物主要有大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)和蓝藻(Cyanobacteria)等。
大肠杆菌(E.coli)是迄今为止研究得最为详尽、应用最为广泛的原核生物种类之一,也是基因工程研究和应用中发展最为完善和成熟的载体受体系统。大肠杆菌是革兰氏阴性菌,一些菌株的染色体DNA已测序完毕,大部分基因的生物功能已被鉴定。由于大肠杆菌繁殖迅速,培养简便,代谢易于控制,利用重组DNA技术建立的大肠杆菌工程菌已大规模用于生产真核生物基因的表达产物,具有重大的经济价值。目前已经实现商品化的多种基因工程产品中,大部分是由大肠杆菌工程菌生产的。但是,大肠杆菌细胞膜间隙中含有大量的内毒素,可导致人体产生热原反应。
枯草芽孢杆菌,又称枯草杆菌,是一类革兰氏阳性菌。它作为基因工程受体菌具有以下优点:①枯草芽孢杆菌具有胞外酶分泌-调节基因,能将基因表达产物高效分泌到培养基中,简化蛋白表达产物的提取和加工处理等过程,而且在大多数情况下,真核生物的异源重组蛋白经枯草芽孢杆菌分泌后便具有天然构象和生物活性;②枯草芽孢杆菌不产生内毒素,无致病性,是一种安全的基因工程菌,枯草芽孢杆菌具有芽孢形成能力,易于保存和培养;③枯草芽孢杆菌也具有大肠杆菌生长迅速、代谢易于调控、分子遗传学背景清楚等优点;④利用DNA重组技术改造枯草芽孢杆菌,可以用于其自身的某些特殊功能蛋白和酶类的规模化生产。
蓝藻,也称为蓝细菌,在细胞结构和生物化学方面与细菌很相似,亲缘关系也较密切。它作为基因工程受体细胞的最大特点是:蓝藻是一类光能自养型生物,由于具有叶绿素a等光合色素(缺少叶绿素b)而能进行光合作用,同时释放出氧气,因此蓝藻培养简便易行,营养条件要求低,并可用于大规模生产。由于密码子的偏好性和启动子的通用性,某些蓝藻可能成为植物基因表达的宿主。随着蓝藻质粒的发现、有关载体的构建和大量突变体细胞的获得,蓝藻基因工程有了长足的发展。
棒状杆菌和链霉菌等受体细胞也可以作为原核细胞受体,进行工程菌的构建并能用来生产抗生素和氨基酸,这是利用大肠杆菌和枯草芽孢杆菌等受体细胞难以完成的工作。
以原核生物细胞来表达真核生物基因也存在一定的缺陷,较多的真核生物基因不能在大肠杆菌中表达出具有生物活性的功能蛋白。其主要原因如下:①原核生物细胞不具备真核生物的蛋白质折叠复性系统,即使许多真核生物基因能得以表达,得到的也多是无特异性空间结构的多肽链;②原核生物细胞缺乏真核生物的蛋白质加工系统,而许多真核生物蛋白质的生物活性正是依赖于其侧链的糖基化或磷酸化等修饰作用而起作用;③原核细胞内源性蛋白酶易降解空间结构不正确的异源蛋白,造成表达产物不稳定等。这在一定程度上制约了原核受体细胞作为生物反应器进行异源真核生物蛋白的大规模生产。