3.2.5　人工构建的质粒载体的功能分类

3.2.5　人工构建的质粒载体的功能分类

在天然质粒的改造过程中，删除了和载体功能无关的DNA区段，进一步缩小了载体的相对分子质量，提高装载量；消除了某些编码基因，如控制质粒进行结合性转移的mob基因，增加了载体的实验室安全性，同时消除了控制质粒拷贝数的阻遏蛋白编码基因，提高了载体在受体细胞内的拷贝数；加入一种或多种选择性标记，使转化子或重组体的筛选更容易；引入含有多种单一限制酶切位点的多克隆位点区域（MSC），便于外源DNA的插入；根据不同载体功能，加入报告基因或标签蛋白编码序列，使载体成为分析DNA功能的工具。人工构建的质粒载体根据其功能可以分为以下几类。

1.克隆载体

这类载体主要用于克隆和扩增外源DNA，其主要特点是在载体内部去除了限制质粒拷贝数的功能区域，因此载体可以在细胞内维持较高的拷贝数，更有利于扩增外源DNA。例如，早期的pBR系列载体、现在实验室常用的Promega公司的pGEM-T系列载体和Takala公司的pMD18-T载体都属于克隆载体。这些载体可以把经过PCR扩增或经聚合酶处理3'末端加A（腺嘌呤）的未知序列的DNA片段直接通过T-A克隆的方法插入载体，为载体构建和未知DNA序列的鉴定提供了更加简洁的解决方案，因此也将这类载体称为T载体。

T-A克隆方法（图3-3）是把PCR片段与一个具有3'端T（胸腺嘧啶）突出的载体DNA连接起来的方法。因为PCR中所适用的聚合酶具有末端转移酶的活性，通常在3'端加上A（腺嘌呤）。例如：Taq聚合酶在每条PCR扩增产物的3'端自动添加一个3-A突出末端，用经过特殊处理的具有3-T突出末端的DNA片断可以通过T-A配对进行连接。如果PCR扩增的目的基因片断中包含未知序列，那么此目的片断可以通过T-A克隆的方法，重组到T载体中，然后利用T载体上已知序列设计引物对未知序列进行核酸测序。由于在PCR过程中，使用的DNA聚合酶不同，往往分为两种情况。①使用不同的Taq DNA聚合酶，在PCR扩增循环结束后，加上72℃10 min处理，Taq DNA聚合酶可以在扩增产物的3'末端加上A，PCR产物回收纯化后和T载体直接连接；②使用高保真的DNA聚合酶，如Pfu酶，由于其不能在扩增产物的3'末端加A，得到的DNA序列为平末端，因此，需要在回收纯化后进行末端加A处理，通常是以PCR回收产物为模板，加上一定量的普通Taq DNA聚合酶和反应缓冲液，加入dATP，72℃处理10 min，然后将加A产物直接用于T-A连接。

2.表达载体

这类载体MCS上游含有针对特定细胞的强启动子和核糖体结合位点，MCS下游会含有强终止子，在真核生物表达载体MCS下游还含有增加mRNA稳定性的poly（A）信号，这些特征都有利于外源基因在特定细胞中高效、稳定表达。如原核细胞表达载体pET系列载体可以诱导外源基因在大肠杆菌中高效表达，并且其MCS下游含有His-Tag标签序列，便于表达蛋白的纯化和鉴定；原核细胞表达载体pGEX系列载体可以在原核细胞内诱导外源基因和GST-Tag融合蛋白表达，通过GST-pulldown技术，为外源基因的功能研究提供了有力的研究工具；真核细胞表达载体pcDNA3.1系列载体可以诱导外源基因在真核细胞内高效表达，是目前实验室常用的真核基因过表达载体，为基因功能的研究提供了有力的辅助工具。

3.探针载体

这类载体主要用于分析基因的功能元件或分析功能蛋白在细胞内的定位等，例如基因启动子活性分析、基因表达负调控元件分析或特定基因表达产物的亚细胞定位分析。对于基因表达负调控元件的分析，主要是通过将要分析的DNA序列插入特定报告基因的上游，让外源DNA调控报告基因的表达，通过报告基因的表达水平变化而分析外源DNA对基因表达的调控功能，例如Promega公司的pGL3系列载体，利用萤火虫荧光素酶作为报告基因来分析基因的启动子活性。特定基因表达产物的亚细胞定位分析，主要是将目的基因和报告基因构建成融合蛋白，利用报告基因的示踪作用而判断目的基因表达产物在细胞内的位置，例如BD公司的pEGFP系列载体，可以利用绿色荧光蛋白（GFP）报告基因进行目的基因的亚细胞定位分析。报告基因的主要特点是易于检测，且检测灵敏度高。

4.整合载体

这类载体进入特定宿主细胞后，可以利用载体所表达的整合酶把插入特定整合位点间的外源DNA切下，并引导外源DNA整合进入宿主细胞基因组，实现外源DNA和宿主细胞DNA的同步遗传与表达。例如植物转基因策略中，基于根癌农杆菌Ti质粒发展的双元载体系统和共整合系统都属于整合载体，最终目的都是将外源DNA和植物细胞基因组整合，实现外源DNA在植物细胞内的稳定遗传与表达。