3.5　噬菌粒载体

在单链噬菌体载体中用于插入外源DNA片段的区域，即基因Ⅱ和基因Ⅳ间的区域，称为间隔区（IG）。这段长度为508 bp的区域不编码蛋白质，但发挥着复制起始和单链DNA包装信号的作用。将IG克隆进质粒载体内部，构建成噬菌粒载体。所以噬菌粒载体是由质粒载体和单链噬菌体载体融合构建的一种人工杂合载体，具有质粒载体和单链噬菌体载体的优点，同时避免了单链噬菌体载体稳定性差、克隆能力低等缺点。

噬菌粒载体具有质粒的复制起点和筛选标记基因，还具有单链噬菌体DNA复制起点，因此它在大肠杆菌宿主细胞中存在两种不同的增殖方式。

（1）质粒增殖方式：以质粒的形式转化宿主细胞，并以质粒复制起点进行复制，其拷贝数与噬菌粒载体中质粒序列的性质有关，并利用质粒筛选标记进行转化子筛选，扩增产物的提取方法和质粒相同，获得的DNA为双链DNA，便于操作，DNA产量高。

（2）单链丝状噬菌体增殖方式：当宿主细胞中含有辅助噬菌体时，噬菌粒载体以单链噬菌体形式进行增殖，按滚环复制模式产生单链DNA，并在细胞膜处包装成噬菌体颗粒，排出细胞。溶液中的噬菌体颗粒便于收集提纯，所获得的单链DNA可直接用于外源DNA片段的测序。在此过程中，辅助噬菌体所表达的蛋白质产物发挥关键作用，其表达的基因Ⅱ蛋白识别载体上来源于噬菌体DNA的复制起始位点，引发载体以单链噬菌体方式增殖。

在丝状噬菌体增殖方式下所需要的辅助噬菌体是一种突变噬菌体，它在宿主细胞中DNA复制效率很低，但其表达产物可以为在同一个宿主细胞中的噬菌粒DNA提供识别和包装所需要的蛋白质。例如，M13K07就是一种辅助噬菌体，由复制起始位点突变的M13mpl噬菌体、p15A质粒和来自Tn903的卡那霉素抗性基因重组而成。当含有噬菌粒载体的宿主细胞被M13K07感染后，M13K07在宿主细胞中以双链质粒p15A复制起点进行复制，并表达出噬菌体载体DNA识别和包装所需要的相关蛋白质，从而引发噬菌粒载体正链DNA（+）合成、包装和释放。但由于M13K07中噬菌体复制起始位点发生突变，因此其合成单链DNA（+）的效率低，最终宿主细胞所释放的噬菌体中绝大部分是由噬菌粒载体包装成的噬菌体颗粒。

噬菌粒载体与M13噬菌体载体相比有很多优势。噬菌粒载体相对分子质量较小，只有3 kb左右，其外源DNA承载量更高；根据需求不同，既可以获得单链DNA，又可以获得双链DNA；当外源DNA片段较大时，M13噬菌体载体在复制时经常发生DNA缺失，稳定性差，但噬菌粒载体更加稳定。实验室常用的噬菌粒载体包括pBS、pRSA101、pGEM-3Zf、pUC118/119、pZ258、pEMBL等。其中，噬菌粒载体pUC118/119（图3-25）是分别以pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体间隔区（IG）进行重组而构建的人工载体。在构建载体过程中将M13噬菌体带有复制起点的IG，长度约476 bp的片段，插入pUC18和pUC19载体的NdeⅠ位点，由于pUC18和pUC19的MCS区域相同，但位点方向相反，因此，所获得的pUC118/119噬菌粒载体是一对互补载体。利用这对载体可以选择性针对外源DNA的正链和负链进行测序操作或点突变研究。而且，这对载体结构简单，最高可以容纳10 kb外源DNA片段。

图3-25　噬菌粒载体pUC118和pUC119结构