4.6.3 基因芯片的制备
基因芯片的制备主要包括4个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应、信号检测与结果分析。
1.芯片制备
目前制备芯片主要以玻片或硅片为载体，采用原位合成和微矩阵的方法将寡核苷酸片段或cDNA探针按顺序排列在载体上。芯片的制备除了用到微加工工艺外，还需要使用机器人技术，以便能快速、准确地将探针放置到芯片上的指定位置。
（1）原位光刻合成寡核苷酸：该技术的原理是在合成碱基单体的5'羟基末端连上一个光敏保护基。合成的第一步是利用光照射使羟基端脱保护，然后一个5'端保护的核苷酸单体被连接上去，如此反复进行，直至合成完毕。使用多种掩盖物能以更少的合成步骤生产出高密度的阵列，在合成循环中探针数目呈指数式增长。某一含n个核苷酸的寡核苷酸，通过4n个化学步骤能合成出4n个可能结构。例如，一个完整的8核苷酸通过32步化学步骤能合成65536个探针。
（2）原位喷印合成：该技术原理与喷墨打印类似，不过芯片“喷印头”和“墨盒”有多个，“墨盒”中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。“喷印头”可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基“喷印”在芯片上特定位置。该技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此不需要特殊制备的化学试剂。
（3）点样法：点样法是将合成好的探针、cDNA或基因组DNA通过特定的高速点样机直接点在芯片上。
2.样品制备
生物样品往往是复杂的生物分子混合体，除少数特殊样品外，一般不能直接与芯片反应，有时样品的量很小。因此，必须将样品进行提取、扩增，获取其中的DNA或RNA，然后用荧光标记，以提高检测的灵敏度和使用者的安全性。荧光标记基本分为两种：一种是使用荧光标记的引物；另一种是使用荧光标记的三磷酸脱氧核糖核苷酸。
3.杂交反应
杂交反应是荧光标记的样品与芯片上的探针进行反应产生一系列信息的过程。选择合适的反应条件能使生物分子间反应处于最佳状况中，减小生物分子之间的错配率。
杂交反应是一个复杂的过程，受很多因素的影响，而杂交反应的质量和效率直接关系到检测结果的准确性。这些影响因素包括：①寡核苷酸探针密度的影响。低覆盖率使杂交信号减弱，而过高的覆盖率会造成相邻探针之间的杂交干扰。②支持介质与杂交序列间的间隔序列长度的影响。研究表明，当间隔序列长度提高到15个寡核苷酸时杂交信号显著增强。选择合适长度的间隔序列，可使杂交信号增强150倍。③杂交序列长度的影响。在杂交反应过程中经常发生碱基错配的现象，区分正常配对的互补复合物与单个或2个碱基的错配形成的化合物，主要依赖于形成的复合物的稳定性不同，而杂交序列的长度是影响复合物稳定性的一个重要因素。一般来说，短的杂交序列更容易区分错配的碱基，但复合物的稳定性要差一些，而长杂交序列形成的复合物稳定，而区分碱基错配的能力要差一些。研究表明，12个、15个、20个碱基产生的杂交信号强度接近，但15个碱基的杂交序列区分错配碱基的效果最好。④GC含量的影响。GC含量不同的序列，其复合物的稳定性也不同。⑤探针浓度的影响。以凝胶为支持介质的芯片，提高了寡核苷酸的浓度，在胶内进行的杂交更像在液相中进行的杂交反应，这些因素提高了对错配碱基的分辨率，同时也提高了芯片检测的灵敏度。⑥核酸二级结构的影响。在使用凝胶作为支持介质时，单链核酸越长，则样品进入凝胶单元的时间越长，也就是越容易形成链内二级结构，从而影响其与芯片上探针的杂交，因而样品制备过程中，对核酸的片段化处理，不仅可以提高杂交信号的强度，还可以提高杂交速度。
4.信号检测与结果分析
杂交反应后的芯片上各个反应点的荧光位置、荧光强度经过芯片扫描仪和相关软件分析，将荧光转换成数据，即可以获得有关生物信息。基因芯片技术发展的最终目标是将从样品制备、杂交反应到信号检测的整个分析过程集成化以获得微型全分析系统（或称缩微芯片实验室）。使用缩微芯片实验室，就可以在一个封闭的系统内以很短的时间完成从原始样品到获取所需分析结果的全套操作。