5.4.1　cDNA文库的构建

5.4.1　cDNA文库的构建

基因组含有的全部基因在特定的组织细胞中只有部分表达，处在不同的环境条件和不同分化时期的细胞，其基因表达的种类和强度也不同，所以cDNA文库具有组织细胞特异性。构建cDNA文库通常包括下列步骤。

1.mRNA提取

根据研究目标合理选择组织细胞，利用poly（A）尾巴纯化或直接提取mRNA。常用的寡聚（dT）纤维素亲和层析柱，可以Oligo（dT）吸附mRNA的poly（A）尾，其他不具poly（A）尾的RNA自柱中流出，然后将mRNA洗脱下来。

2.cDNA合成

由mRNA到cDNA的过程称为逆转录，常用禽类成髓细胞病毒（AMV）逆转录酶和鼠白血病病毒（MMLV）逆转录酶催化。

（1）cDNA第一链的合成。

逆转录酶是依赖RNA的DNA聚合酶，合成DNA需要引物引导。常用引物如下。

①Oligo（dT）引物：常用Oligo（dT）引物与mRNA 3'末端的poly（A）配对，引导逆转录酶以mRNA为模板合成第一链cDNA（图5-8）。

②随机引物：常用化学合成的6～10 nt随机引物，与mRNA分子多处配对，从多个位置合成cDNA第一链，能产生近全长cDNA，适合得到cDNA的5'末端。

③基因特异引物（gene-specific primer，GSP）：仅逆转录特定目的基因cDNA的5'末端。

（2）cDNA第二链的合成。

cDNA第二链的合成是将mRNA-cDNA杂交双链变成互补双链cDNA。cDNA第二链的合成有以下四种方法。

①自身引导法：合成的单链cDNA 3'末端能形成一个发夹结构，为第二链的合成提供引物，引导第二链的合成。当第一链合成反应产物的DNA-RNA杂交链变性后，利用大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ或逆转录酶合成cDNA第二链，最后用对单链特异性的S1核酸酶消化该环处理去除发夹结构，即可进一步克隆。缺点：在以S1核酸酶切割cDNA的发夹结构时，会导致对应于mRNA 5'末端的序列出现缺失和重排，得到的5'末端不完整，且S1核酸酶处理不好控制，易导致cDNA的丢失，所以该法现已少用。

②置换合成法：第一链在逆转录酶作用下产生的cDNA-mRNA杂交链，不用碱变性，而是在dNTP存在下，利用RNase H在杂交体mRNA链上造成切口和缺口，产生一系列mRNA短片段，作为合成第二链的引物，在大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ和DNA连接酶作用下合成cDNA第二链（图5-9）。此法可得到近全长cDNA，但5'末端可能缺失短序列。置换合成法的优点：合成cDNA效率高；直接利用第一链反应产物，无须进一步处理和纯化；不必使用S1核酸酶来切割双链cDNA中的单链发夹环。

③引导合成法：利用末端转移酶在cDNA第一链的3'末端加上poly（dC）尾巴，利用poly（dG）为引物引导第二链合成，利用同源多聚尾与载体进行重组。

④引物-衔接头合成法：此法是引导合成法的改进型，如图5-10所示，在逆转录引物和poly（dG）引物的5'末端引入人工接头，可用PCR扩增总cDNA，也为总cDNA与载体的连接提供酶切位点。

3.双链cDNA的分子克隆

双链cDNA合成后，用末端转移酶给双链分子加尾，或者将人工合成的衔接物加到双链cDNA两端，再同经适当处理而具有相应末端的质粒或噬菌体载体连接。

4.双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖

将构成的重组体分子导入大肠杆菌宿主细胞进行扩增，便得到所需的cDNA文库。