8.4.2 哺乳动物基因表达载体
哺乳动物细胞表达外源重组蛋白所用的载体按照进入宿主细胞的方式可分为质粒载体和病毒载体两类。利用质粒载体获得稳定的转染细胞所需时间长，一般要几周甚至几个月，大大限制了该类载体的应用；病毒具有快速感染细胞的能力，只需要几天就可获得整合了外源基因的病毒载体，因此与质粒载体相比，病毒载体具有很多优点，尤其适合目的蛋白的大量表达和检测。
病毒载体是以病毒颗粒表面的包膜蛋白与宿主细胞膜上的受体进行相互作用，通过病毒包膜与宿主细胞膜相融合的方式使外源基因进入细胞内。常用的病毒载体包括SV40病毒载体、逆转录病毒（retrovirus，RV）载体、腺病毒（adenovirus，AV）载体、腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus，AAV）载体、单纯疱疹病毒（herpes simplex virus，HSV）载体以及慢病毒（lentivirus，LV）载体等。
1）SV40病毒载体
SV40病毒是环状双链DNA病毒，是乳多空病毒的一种，可以裂解性感染猴源细胞，是在人和猴中都已发现的致瘤病毒。SV40基因组长5.2 kb，可与宿主的组蛋白H4、H2a、H2b和H3结合形成微型染色体。根据基因表达的先后顺序可分为早期基因和晚期基因。早期基因有大T抗原基因和小t抗原基因。晚期基因有VP1基因、VP2基因和VP3基因。SV40载体有取代型载体和病毒-质粒重组克隆载体。取代型载体是由用外源DNA取代SV40的晚期基因片段或部分早期基因片段构建而成的克隆载体，被取代的DNA序列不能超过SV40基因组的30％。由于病毒基因缺失，必须在辅助病毒存在下才能包装成完整的病毒粒子。病毒-质粒重组克隆载体则具有更大的装载容量和宿主范围。如SV40穿梭型质粒pEUK-Cl（图8-11）就是病毒-质粒重组克隆载体，适合于外源基因在哺乳动物细胞中的瞬时表达。
2）逆转录病毒载体
逆转录病毒是一类用于构建哺乳动物基因整合型载体的正链RNA病毒。逆转录病毒是国际病毒分类标准中一个科的总称，包含α-、β-、γ-、δ-、ε-逆转录病毒以及慢病毒（Lentivirus）和泡沫病毒（Spumavirus）七个属，其基因组由顺式作用DNA序列（LTR、ψ和PB±）和反式作用DNA序列（gag、env和pol）组成，长度为5～9 kb，如小鼠乳腺瘤病毒（MMTV）以及小鼠白血病病毒（MMLV）。逆转录病毒在宿主细胞中转变成双链DNA形式整合到宿主基因组DNA中，能持久地表达外源基因，而且能感染几乎所有类型的哺乳动物细胞，是一种较为理想的转基因载体。逆转录病毒载体有以下特点：逆转录病毒结构基因gag、env和pol为病毒活性的非必需基因，用外源性基因代替这部分病毒基因不会影响病毒的活性，但装载量最大约8 kb。这类载体分子的复制是缺陷型的；env编码的囊膜糖蛋白能与许多哺乳动物细胞膜上的特异性受体相结合，介导逆转录病毒的遗传物质RNA高效地进入宿主细胞，并通过逆转录形成cDNA，在病毒自身表达的整合酶作用下整合到宿主染色体上，使外源基因可以在宿主细胞中稳定地表达。在整合的原病毒中的U3元件含有TATA盒，同时也有poly（A）信号AATAAA，它们对增强转录以及维持RNA的稳定十分重要。LTR也是原病毒基因组与宿主基因组的连接部位，对原病毒的整合以及病毒DNA的合成都必不可少。病毒颗粒在包装后通过出芽方式形成具有包膜的成熟病毒粒子并脱离宿主细胞，因此容易与宿主细胞分离（图8-12）。逆转录病毒载体基因转移系统包括两部分：一部分是用外源基因替换病毒结构基因的重组逆转录病毒载体；另一部分是基因组DNA中整合了逆转录病毒基因的包装细胞。
图8-11 SV40穿梭型质粒pEUK-C1结构示意图
（引自刘志国等，2003）
图8-12 逆转录病毒载体pLXSN的结构
（引自李立家等，2004）
目前较常用的逆转录病毒载体是用Moloney小鼠白血病病毒（moloney murine leukemia virus，MMLV）与质粒pBR322组建而成，该病毒载体可以在体外大量扩增。逆转录病毒的宿主范围由病毒颗粒表面的囊膜表面蛋白Env蛋白决定，因此，可通过改变Env蛋白来改变载体的靶向性。水疱性口炎病毒的糖蛋白能抵抗血清补体的灭活作用，这种糖蛋白整合于逆转录病毒包膜中能扩大宿主范围，加速对各种宿主细胞的识别、膜融合和内吞，提高转染效率，特别是对静止细胞的转染效率很高。
逆转录病毒载体具有基因表达持久而稳定、转染效率较高等优点，它可以克隆并表达外源基因，但不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。这些优点使逆转录病毒载体在介导哺乳动物细胞表达外源蛋白方面有良好的应用前景，但仍有需要进一步改善的地方。逆转录病毒载体一般只能感染分裂期细胞，且载体容量小于8 kb，随机整合到宿主细胞基因组可引起基因突变，通过复制后可产生有活性的病毒颗粒。为了提高逆转录病毒感染靶细胞的特异性，降低其潜在的危险性，可以在病毒Env蛋白上接上一段具有特异靶向的单链可变区抗体（single chain variable fragments antibody，ScFV）。Martin等设计的逆转录病毒能特异性靶向黑色瘤细胞，其原理是在病毒包被糖蛋白的表面结构域（SU）上依次接上间质金属蛋白酶的酶切位点、一段富含脯氨酸的肽段以及一段特异识别高相对分子质量黑色素瘤相关抗原（high molecular weight melanoma-associated antigen，HMW-MAA）的ScFV，这种改造过的载体在scFV的导向下达到肿瘤细胞，大大提高了载体靶向的特异性。还可通过插入组织特异启动子实现靶向表达。第三代包装细胞系Ψ2crip和Ψcre使载体与包装细胞间至少需要发生4次同源重组才可能产生有复制能力的逆转录病毒，提高了逆转录病毒载体的安全性。
3）腺病毒载体
一般来讲，外源基因常插入腺病毒早期基因El、E2、E3、E4区（见3.6.1小节）和右端ITR之间。E1或E3基因缺失的第一代腺病毒载体需要辅助病毒的作用进行复制，可引发机体产生较强的炎症反应和免疫反应，影响转染效率。E2A或E4基因缺失的第二代腺病毒载体，其病毒晚期基因表达产物大大减少，引起的免疫反应明显减弱，外源基因表达显著提高，其载体容量和安全性方面也改进许多。而缺失了全部的（无病毒载体，gutless vector）或大部分腺病毒基因（微型腺病毒载体，mini Ad）的第三代腺病毒载体则仅保留ITR和包装信号序列，最大可插入35 kb的基因，病毒的复制受到抑制，腺病毒载体引起的细胞免疫反应进一步减少，引入核基质附着区基因的载体可使外源基因保持长期表达，载体的稳定性也有所增加。这一载体系统可用腺病毒突变体作为辅助病毒。腺病毒作为转化载体的特点如下：基因组重排率低，外源基因与病毒载体DNA重组后能稳定复制几个周期；安全性能好，不整合人类基因组，不会导致恶性肿瘤发生；宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂期要求不严格；转染效率和重组病毒滴度高，外源基因在载体上容易获得高效表达。腺病毒载体最大的缺陷是重组的外源基因不能持久表达，而且病毒蛋白对体液和T淋巴细胞具有免疫原性。
4）人乳多空BK病毒载体
人乳多空BK病毒（human papova BK virus，BKV）能以多拷贝游离的双链DNA形式在哺乳动物细胞中培养并维持很多代。将该病毒的其他基因删除，只保留复制功能的区域，使其与大肠杆菌质粒整合形成穿梭载体。将SV40的新霉素抗性基因启动子和小鼠乳腺癌启动子（MMTP）加入该载体，在二噁英存在时可增强mRNA的合成，并可用G418来筛选重组子。将目的基因整合到DRE-MMTP启动子的3'端后，可用TCDD（2，3，7，8-tetrachlorodibenzop-dioxin）诱导表达重组蛋白。
5）牛痘病毒载体
牛痘病毒和疱疹病毒一样，是一种大型DNA病毒，基因组长约185 kb，能在宿主细胞质中自主复制。牛痘病毒是一种可引起牛产生轻微牛痘病灶的病毒。人若感染该病毒，只会产生轻微不适，并产生抗牛痘病毒的抵抗力。18世纪后，牛痘病毒用于免疫接种以预防高传染性的天花，这也是免疫接种的首个成功案例。以前，外源基因直接插入病毒基因组的非必需区，构建出的重组病毒具有感染活力，外源基因可在最邻近的病毒启动子控制下迅速转录。因为牛痘病毒基因组很大，一般采用体内重组方式来重组外源基因。牛痘病毒曾经广泛用作天花疫苗，对其研究较为深入，这是牛痘病毒被选择作为基因载体的基础。牛痘病毒可用鸡胚成纤维细胞、RK13、BHK和小鼠L细胞进行培养。
目前使用的牛痘病毒载体是预先构建好的重组病毒，含有细菌T7RNA聚合酶基因。重组病毒感染细胞后，产生大量的T7RNA聚合酶，当外源基因和T7启动子随质粒进入受体细胞后，外源基因在T7RNA聚合酶作用下转录并翻译形成异源蛋白。研究人员采用这种方法高效表达人囊状纤维化基因。
6）单纯疱疹病毒载体
作为双链DNA病毒的单纯疱疹病毒载体表达外源基因，可以容纳40～50 kb的外源基因。该病毒对神经元具有特异性感染的特性，适合于神经系统疾病如帕金森病、阿尔茨海默病等的基因治疗。但该载体的细胞毒性需要进一步改善，去除早期基因可降低其毒性。
7）慢病毒载体
慢病毒为二倍体逆转录RNA病毒，有灵长类病毒如人类的HIV、猴类的SIV以及非灵长类的马EIAV。目前以HIV载体研究较多，它具有可感染非分裂期细胞、容纳量大、持续表达外源基因、免疫反应小等优点。SIV与HIV-1同源性高且感染宿主之后的病理过程及免疫反应相似，因此，SIV猴模型可以有效地评价HIV疫苗效果。EIAV载体是一种可与HIV载体相比的慢病毒载体，已经用于神经元细胞、神经胶质细胞、造血细胞以及肌肉细胞中进行基因转移。