脾气虚证动物模型的指标评价
(一)宏观指标
《中医临床诊疗术语》指出,脾气虚证是指气虚脾失健运,以食少、腹胀、大便溏薄、神疲、肢体倦怠、舌淡脉弱等为常见症的证候。同时,《中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》也给出脾气虚证的主要症状为胃纳减少或食欲差、大便不正常(溏、烂、先硬后溏、时溏时硬)、食后腹胀或下午腹胀。根据以上两项用于人类脾气虚证的诊断的原则,结合国内学者对动物脾气虚的症状判定,认为动物模型的脾气虚证宏观指标应从体征、毛发、活动状况、舌象、体重、体(肛)温、体长、进食量、饮水量、游泳时间等方面来判断是否脾气学动物模型是否建模成功。
多位学者对此做出探索。陈小野等通过实验总结了脾气虚证的宏观指标,认为出现精神倦怠、嗜卧、懒动、拱背、扎堆、眯眼、受惊动时无神、抓取时挣扎无力等倦怠表现,出现毛色枯黄甚至稀少、耳尾色白等脾气虚不濡养肌肤的表现,出现便溏、泄泻、受激排便率增高等排便改变,或通选舌淡苔少、体质量增长缓慢或下降、体温不变或略有降低、食量减少、游泳时间缩短等均可认为是脾气虚证。田茸等依据卫生部(现卫健委)药政局颁布的《中药治疗脾气虚证的临床研究指导原则》将大鼠的脾气虚症状通过评分来进行判断是否建模成功,判定标准如下:蜷缩扎堆1分,眯眼拱背1分,食量减少1分,体质量减轻1分,便形质软1分,便形溏稀2分,肛温下降2分,游泳耐力下降1分;得分为5分以上者模型构建成功;评分总和增加提示症状加重。以此来量化动物模型脾气虚证是否构建成功。
中华中医药学会脾胃病分会所形成的脾虚证中医诊疗专家共识意见根据全国中西医结合虚证老年病防治学术会议制定的“中医虚证参考标准”及北京师范大学构造脾虚模型的标准制定了相应的动物模型评价标准:①泄泻严重者甚至脱肛。②食少纳呆。③消瘦,体质量减轻。④神态萎靡,四肢不收,毛色枯槁。⑤蜷缩聚堆。⑥易疲倦。第①②项为主症,第③至⑥项为兼症,具备2项主症及2项兼症时,即可认定脾气虚证模型造模成功。
也有学者根据不同的脾气虚证造模方法来分别说明出现哪些宏观指标可定义为脾气虚证,如苦寒泻下法所致的脾气虚模型以便溏、脱肛、消瘦、皮毛枯槁、蜷缩、精神萎靡、拱背等症状较为常见,饮食不节法所致的脾气虚模型常见体重减轻、少动、皮毛枯槁、体温降低、蜷缩、拱背、嗜睡等症状,劳倦过度法所致的脾气虚模型以精神萎靡、倦怠、懒动、扎堆、皮毛枯槁、眯眼、抓取时挣扎无力等症状较为常见。
此外,实验动物不同,其脾气虚所表现的症状也有所不同,小鼠常表现为便溏、脱肛、皮毛枯槁、纳呆、体重减轻、少动、四肢无力、精神萎靡、眯眼、体温降低等;大鼠常表现为便溏、皮毛枯槁、消瘦、食量减少、体重增长缓慢、精神萎靡、蜷缩、嗜睡、懒动、拱背等;家兔常表现为便溏、食量减少、腹胀、体重减轻、消瘦、皮毛枯槁、少动、拱背、蜷缩、体温降低等。这在脾气虚证动物模型评价时需要特殊注意。
(二)微观指标
虽然参照《中医临床诊疗术语》《中药治疗脾虚证的临床研究指导原则》等临床诊断脾气虚证的原则可以从宏观上判断实验动物是否出现脾虚,但这种从外观体征上的评价大多以定性描述为主的,没有加入定量外观评价对揭示脾气虚证本质还不够全面,无法为中医基础和临床研究筛选出更为客观的脾气虚动物模型。根据动物模型脾气虚证诊断的规范化要求,学者引入“临床流行病学”方法,力求开展实验动物脾气虚证半定量化、定量化、客观化和标准化的诊断研究的各种探索;力求建立西医微观指标与中医“证候”的联系。从细胞、分子水平、理化、免疫、代谢、微量元素等方面来探讨与脾气虚证间的关系,旨在筛查脾气虚证的微观指标,从而构建评价脾气虚证的微观指标体系,更好地评价脾气虚证动物模型。
研究从功能、细胞分子水平,围绕免疫、内分泌、神经等多个层面提出可判定脾气虚证的理化、生物学等微观指标。
(1)消化功能层面:表现为消化道推进速度增快、胃泌素分泌减少。
(2)组织器官层面:出现脾脏指数降低、肝脏湿重降低,胃肠黏膜水肿或糜烂、胃肠黏膜点状或片状出血等变化,同时内分泌腺如肾上腺、睾丸等萎缩、退变。
(3)细胞层面:胃黏膜实质细胞(主细胞、壁细胞、颈黏液细胞)幼稚化,自然杀伤细胞(NK细胞)活性降低,巨噬细胞活性降低。
(4)免疫系统方面:细胞免疫功能下降,出现胸腺萎缩、胸腺皮质厚度减少,脾脏中央动脉周围淋巴鞘直径减少等现象,血液检查显示外周血T淋巴细胞总数(CD3+细胞)减少,T细胞亚群变化见CD4+细胞降低、CD8+细胞不变或升高、CD4/CD8比值降低,脾脏细胞增殖反应降低等。
(5)神经系统方面:交感神经功能亢进、副交感和交感神经应激能力低下、血浆儿茶酚胺神经递质改变。
(6)其他:血木糖含量及吸收率下降,尿木糖排泄率降低,血浆环磷酸腺苷(cAMP)含量降低、环磷酸鸟苷(cGMP)含量升高或不变、cAMP/cGMP比值降低,胃肠黏膜屏障TLR-2、MyD88蛋白表达上调等。
由于研究者本身和实验动物本身等因素影响,上述指标仅能表示脾气虚证动物模型的部分改变。事实上,当前反映动物模型脾气虚证的微观指标种类繁多,差异较大,目前尚未达成共识,仍需继续挖掘可诊断动物模型脾气虚证的关键分子。
(三)方剂反证
根据应用健脾益气法后脾气虚证动物模型的症状改善情况可反证是否成功建立脾气虚证动物模型,研究中常用此方法,最常用的健脾益气方剂为四君子汤,多篇文献指出,四君子汤可通过调节CaM-MLCK信号通路,提高血清生长激素释放肽(Ghrelin)含量,改善肠道菌群多样性等,使脾虚证大鼠症状得到有效改善。除此外,脾气虚模型的反证运用的方剂还包括理中丸、补中益气汤、白术茯苓汤、不换金正气散、藿朴夏苓汤等。反证方剂的不同说明导致脾气虚的侧重点不同,体现造模方法的不同,这是跟中医证候学密切相关的。