医学微生物学研究方法
微生物是存在于自然界，体形微小，结构简单，肉眼不可见，需借助显微镜放大才能观察到的微小生物。医学微生物主要研究与医学有关病原微生物的生物学特性、致病性和免疫机制，特异性诊断、防治措施，以控制甚至于消灭人类感染病为宗旨的一门科学，目前还扩展研究对人类健康有益的微生物。通常认为中医学说中的“外邪”即指病原微生物的感染，中医临床的“六经传变”与“卫气营血传变”规律就是对感染性疾病临床变化规律的一种系统总结，有许多方面与现代医学微生物学的致病性相契合。在中医的临床实践中，形成了许多抗微生物感染的方药，为人类与致病微生物的斗争提供了许多极为宝贵的药用资源，更为难能可贵的是，中药学最早将微生物资源直接纳入了药材领域与制药过程，如灵芝、冬虫夏草等真菌的药用，以及六曲的制作等。
研究人体与其内环境的微生态平衡、微生态失调及微生态调整的学科称为医学微生态学，是医学微生物学的一个重要分支。其研究范围包括微生物与人体的相互关系与相互作用的规律。
人与哺乳动物在出生时是无菌的，出生后很快被微生物定植，通过演替过程，在体表和与外界相通的腔道形成一个正常的微生物群落，这一微生物群落可伴随终生，直至宿主死亡。庞大的正常微生物菌群以一定的种类和比例存在于机体的特定部位，参与了机体的生命活动，与宿主细胞进行着物质、能量和基因的交流，在宿主的生长发育、消化吸收、生物拮抗及免疫等方面发挥着不可替代的生理功能，共同维持着生命过程。通常把这些在人体各部位经常寄居而对人体无害的微生物称为正常微生物群（Normal flora），而由正常微生物群所构成的人体内环境则称为微生态系（Microbial ecosystern）。分布在消化道、呼吸道、口腔、泌尿生殖道及皮肤的正常微生物群在数量及种类比例上维持稳定状态，与宿主和环境相互依赖、相互作用形成平衡，维持机体的健康，称为微生态平衡。不同年龄、不同发育阶段、不同种属、不同生态空间都有其特定的生态平衡。在外环境影响下，正常微生物群之间以及正常微生物群与其宿主之间的微生态平衡由生理性组合转变为病理性组合的状态，即为微生态失调微生态失调常可致使疾病的发生。
著名微生态学家魏曦教授在《微生态学刍议》一文中写道：“中医的四诊八纲是从整体出发，探讨人体平衡和失调的转化机制，并通过中药使失调恢复平衡，因此，微生态学很可能成为打开中医奥秘大门的一把金钥匙。”中医认为“脾为后天之本”，即为后天水谷运化中心，医学微生态学证实人体肠道菌群占全身菌群数量的65％以上，即也是人体微生态的主体、中心。研究表明，中草药多种有效成分正是通过肠道细菌的作用，调节人体微生态环境，使之达到平衡，才能发挥药效，从而使人体恢复健康，中草药药效的发挥依赖于肠道正常微生物群的酶代谢作用。
随着基因测序技术的快速发展，人们对肠道菌群的研究逐渐深入，肠道菌群这一“人体第二基因组”逐渐揭开了面纱。肠道菌群种类多且数量惊人并且功能丰富。主要的菌种为厚壁菌和拟杆菌还有变形杆菌。在人的不同年龄阶段，肠道菌群的种类和数量有着不同的特征，处于“年龄相关”的动态增长状态。肠道微生物定性检测方法有以下几种：
（一）肠道微生物定性检测方法
1.测序方法
（1）16S rRNA全长基因测序法：该技术的基本原理是通过克隆微生物样本中的16S rRNA基因片段后构建文库，再通过测序获得16S rRNA基因序列，并与已知的数据库中的序列进行对比，确定其在进化树中的位置，从而鉴定并判断样本中可能存在的微生物种类。具体步骤包括：①从样品中分离总微生物DNA：从样品中提取微生物遗传物质DNA或RNA，这是进行PCR扩增16S rRNA 的前提。一种方法是直接提取总DNA，另一种选择是提取微生物细胞中的rRNA。RNA的提取技术相对于DNA的提取较为复杂。②普通PCR扩增16S rRNA基因片段；双链DNA（模板）加热变性为单链；引物与模板DNA单链结合；引物延伸扩增。③通过16S rRNA基因片段分析对微生物进行分类鉴别。该方法的优点是高效、准确、简便、特异性强。通过16S rRNA全长基因测序法，研究了很多种动物的胃肠道微生物多样性。
（2）焦磷酸测序法：该技术的基本原理：引物与模板DNA经过退火，在酶的共同作用下将引物上每一个脱氧核糖核苷三磷酸（dNTP）的聚合与一次荧光信号的释放偶联起来，再通过检测荧光信号的强弱程度，实时测定DNA序列。
2.指纹图谱
（1）变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）基本原理：由于碱基序列上含有同样长度但序列不同的DNA片段，将它们放入同一个添加有变性剂的凝胶中电泳，由于电泳速度不同，通过对DNA染色区分不同长度的DNA片段。
（2）核糖体基因间隔区分析法：该方法的原理是通过普通PCR扩增16S和23S rRNA之间的基因，由于16S-23SrRNA基因间隔区（Intergenic spacer region，ISR）具有显著的长度特异性，变性后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，再进行银染显影，最后可以形成特异性长度多态性图谱。该种方法可应用于以下水平的分类鉴定，准确评估指纹结构群体。
3.基因芯片技术
基因芯片是指按照预先设定好的位置固定在载体上面的面积很小的数以千万个核酸分子所共同组成的探针阵列。该方法的基本原理是在特定的条件下，固定在载体表面的核酸分子所形成的高密度DNA微阵列可以与来自样品的序列进行互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行特殊标记，就可以检测到杂交信号。基因芯片技术包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和杂交信号检测、结果分析。
（二）肠道微生物定量检测方法
实时荧光定量PCR技术是将荧光基团加入到PCR反应体系当中，通过检测荧光信号的积累实时监测PCR过程，最后通过绘制出标准曲线对未知模板进行定量分析的一种方法。该技术具体步骤包括：①提取样本PCR。②PCR质量检测。③合成cDNA。④梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因实时定量PCR。⑤制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板。⑥待测样品的待测基因实时定量PCR。⑦实时定量PCR使用引物列表。⑧电泳。荧光定量PCR优点是高敏感性，有相应的数字结果，更加直观和规范，但该方法只能对检测的基因有定量的了解，也会有假阳性结果出现。
（三）肠道微生物定性及定量检测方法
1.末端限制性片段长度多态性分析
末端限制性片段长度多态性分析采用有一端被荧光标记的引物进行普通PCR，扩增16S rRNA基因，再用对应的限制性内切酶消化PCR产物，由于不同菌的16S rRNA基因序列有差别，酶切后便会产生不同长度的限制性片段，最后利用测序仪器进行测序分析。最终所获得的图谱中波峰的多少提示了群落的复杂程度，峰面积的大小表明该片段的丰度，能够揭示微生物的群落结构、功能以及动态变化。
2.FISH荧光原位杂交技术
荧光原位杂交技术是一种利用荧光标记已知序列的单链核酸并将其作为探针，再按照碱基互补配对的原则，将其与待检测样本中互补的单链核酸特异性结合，通过荧光显微镜检测样本上杂交荧光的位置，从而将特定的基因在染色体上定位的方法。
（四）肠道微生物的宏基因组学方法
宏基因组学是指直接从样品中提取全部微生物的DNA，然后根据提取出的DNA信息构建一个宏基因组文库，运用基因组学的方法来研究样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。宏基因组学是在微生物基因组学的基础上发展而来的，它的诞生为微生物多样性的研究、新的生理活性物质的研究提供了新的理念和方法。