从脾论治心力衰竭与心肌能量代谢

这是一项四君子汤对慢性心衰大鼠心肌组织蛋白质组学影响的研究。方焕松等将42只SD雄性大鼠，随机留取6只作为正常组，其余36只参照文献采用10%乌拉坦（0.7 g/kg）腹腔麻醉，左上腹切口，使腹主动脉充分暴露，在双肾动脉上方0.5 cm处将8号针头与腹主动脉共同结扎，拔除针头，造成腹主动脉管腔环形缩窄50%～60%，缩窄8周。术后青霉素5万U/只肌肉注射1周，预防感染。正常组大鼠同法打开腹腔，但不进行腹主动脉结扎，其余操作同上。8周后检测血流动力学指标，LVEDP≥15 mmHg，判断心衰模型构建成功。造模成功后，分为模型组9只，四君子汤（药物组成：人参、白术、茯苓、炙甘草）高、低剂量组各9只，卡托普利组9只。四君子汤高、低剂量组分别予四君子汤11.88g/（kg·d）、2.97 g/（kg·d）灌胃；卡托普利组予卡托普利片100 mg/（kg·d）灌胃；正常组、模型组均予等容积0.9%氯化钠注射液灌胃。5组均连续灌胃给药1个月。分别留取各组大鼠左心室组织，双向凝胶电泳分离心肌蛋白，分析差异显示的蛋白，并对有显著差异的蛋白点进行胶内酶切和质谱鉴定。对双向电泳蛋白分辨率和匹配率的影响：用24 cm IPG干胶条（pH 4～7）和12.5%聚丙烯酰胺凝胶进行双向电泳，模型组和四君子汤高剂量组各重复1次，凝胶经考染、扫描后，计算机图像分析，结果显示模型组可分辨蛋白点为（1615±7）个，匹配率为82.26%；四君子汤高剂量组可分辨蛋白点为（1583±60）个，匹配率为82.27%。对心肌组织蛋白质表达的影响：对2组胶进行差异性分析，结果显示各组间蛋白质斑点发生显著性变化，四君子汤高剂量组与模型组比较，表达明显差异的点共59个，其中表达明显增强的点有31个，表达明显降低的点有28个。2组蛋白点的Volume值相差≥1.5倍时，认为有统计学差异。对其中有统计学差异的16个蛋白点进行质谱分析，运用Moscot软件搜索NCBInr数据库，鉴定分值（Score）＞61，认为差异有统计学意义。

共有15个点得到阳性鉴定，通过整合重复蛋白点后，确认4个为差异蛋白质点，其中四君子汤高剂量组与模型组比较，表达上调的点有2个：Suclg2蛋白、肌球蛋白轻链2（Myosin regulatory light chain 2，MLC-2）；表达下调的点有2个：丝氨酸蛋白酶抑制剂A3N（Serine protease inhibitor A3N）、丙酮酸脱氢酶复合体（Pdhx protein，Pdhx）。Suclg2蛋白属于琥珀酰辅酶A连接酶家族，琥珀酰辅酶A是三羧酸循环的重要组成成分，催化该循环中唯一发生在底物水平磷酸化的步骤，使琥珀酰辅酶A转化成琥珀酸盐，它有α和β两种亚基构成，β亚基决定二磷酸鸟苷（GDP）和二磷酸腺苷（ADP）的底物特异性，α亚基由Suclg1基因编码，β亚基由Sucla2和Suclg2编码，Sucla2决定ADP的特异性亚基，Suclg2决定GDP的特异性亚基。三羧酸循环是生物机体获取能量的主要方式，是糖、脂肪和蛋白质3种主要有机物在体内彻底氧化的共同代谢途径，Suclg2的表达水平与心肌的能量代谢水平有密切联系。Miller等研究发现Suclg2基因敲除的患者和控制成纤维细胞都表现出线粒体DNA数量的显著减少和核苷二磷酸激酶、环氧化酶活性的显著降低。实验研究结果表明，四君子汤能显著提高心肌组织Suclg2的表达，方焕松课题组早期研究发现四君子汤可以改善脾虚模型大鼠心肌线粒体的功能，修复损伤线粒体，并能增加线粒体数量，其作用机制可能与此有关。

MLC-2的作用是调控肌肉收缩，MLC-2基因敲除小鼠的mRNA和蛋白分别减少了50%和25%，心脏功能和肌纤维组织均受损，说明MLC-2能影响心肌收缩功能。研究认为心肌收缩蛋白功能低下，与心衰的发生发展密切相关。研究中四君子汤组MLC-2的表达升高，可能会使心肌的收缩功能得到提高，从而改善心功能。

Pdhx是生物体内催化丙酮酸转变成乙酰辅酶A的3种酶及5种辅酶的组合，是糖有氧氧化过程中的一组限速酶，在线粒体呼吸链能量代谢中的作用至关重要。脂肪酸氧化代谢和葡萄糖氧化代谢之间存在相互反馈调节关系，脂肪酸氧化代谢增强可以抑制葡萄糖氧化。有研究发现缺血再灌注期间脂肪酸的氧化迅速恢复成为能量主要来源，丙酮酸氧化被抑制。丙酮酸脱氢酶复合体表达下降的原因可能是四君子汤改变心肌的供氧或者供能底物，使脂肪酸的氧化代谢增强，抑制了糖酵解，增加了葡萄糖的有氧氧化，从而改善心肌的能量代谢。

以上研究提示益气健脾能影响心力衰竭大鼠心肌组织多种蛋白表达，减少心肌重构，可能通过调节能量代谢、提高收缩功能而改善心功能。