从脾论治血脂异常与胆固醇代谢相关研究
（一）肝脏胆固醇代谢相关基因表达
杜莹等围绕健脾降脂中药对脾失健运膏脂转输障碍大鼠肝脏胆固醇代谢相关基因表达的影响开展了实验研究。研究采用随机数字表法将90只大鼠分为空白对照组、模型组、健脾降脂治疗组（治疗组）3组，每组30只大鼠。正常组予普通颗粒大鼠饲料喂养，模型组和治疗组采用劳倦过度加饮食不节结合高脂饲料（10%猪油，1%胆固醇，0.5%胆酸钠，0.2%甲基硫氧嘧啶，5%蔗糖，83.3%基础饲料）喂饲造模法，具体的方法为：大鼠每日游泳至耐力极限，单日以精炼猪油每次3mL，每天2次灌胃，双日不限量地喂食甘蓝，自由进水，造模时间为30天。在造模成功以后，空白对照组和模型组采用生理盐水灌胃（20mL/kg），治疗组予健脾降脂中药（20mL/kg），1次/天，连续30天治疗。全自动生化分析仪检测血清TG、TC、HDL-C和LDL-C含量，油红O染色观察肝脏脂质沉积，采用实时定量RT-PCR和Western blotting技术检测大鼠肝组织B类Ⅰ型清道夫受体（SR-BⅠ）、肝低密度脂蛋白受体（LDL-R）、卵磷脂胆固醇酯酰基转移酶（LCAT）等基因mRNA和蛋白水平。健脾降脂中药主要由党参、灵芝、泽泻、远志、山楂、丹参等组成，与模型组相比，健脾降脂治疗组大鼠TC、LDL-C显著下降，HDL-C显著升高，肝细胞中脂质沉积明显减少，提示健脾降脂中药具有较好的调脂作用。进一步研究发现，健脾降脂中药可通过上调LDL-R的表达，促进胆固醇内吞进入肝脏代谢转化，降低血清胆固醇水平，同时通过上调LCAT、SR-BI的表达，增强胆固醇的逆向转运。有研究也证实，方中的泽泻既能干扰外源性胆固醇的吸收，又能影响内源性胆固醇的代谢。丹参主要抑制内源性胆固醇的合成，山楂能增加胆固醇的排泄，提示健脾降脂中药是通过胆固醇代谢各环节的多靶点效应调节机制来发挥其药理效应。
冷雪等围绕化瘀祛痰方对脾虚型高脂血症大鼠肝脏SREBP-2信号通路的干预作用开展了实验研究。实验中100只SPF级SD大鼠随机分为空白对照组、高脂血症组、高脂血症治疗组、脾虚型高脂血症组、脾虚型高脂血症治疗组，每组20只大鼠。空白对照组给予普通大鼠颗粒饲料喂养；高脂血症组和高脂血症治疗组给予高脂饲料；脾虚高脂血症和脾虚高脂血症治疗组采用劳倦过度和饮食不节进行造模，单日除饲喂高脂饲料外，予精炼猪油灌胃，每次3mL，每日2次，双日喂食甘蓝不限量，造模时间30天。高脂血症治疗组和脾虚高脂血症治疗组灌胃化瘀祛痰方煎剂（20mL/kg），1次/天，连续30天。全自动生化分析仪检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C、血清淀粉酶（AMY）水平，间苯三酚法测定D-木糖排泄率，HE染色观察肝脏形态变化，油红O染色观察肝脏脂质沉积，实时定量RT-PCR及Western blotting技术分别检测HMGCR、CYP7A1、LDL-R、SREBP-2 mRNA和蛋白表达。研究结果显示，当TC含量及血脂含量增加时，脾虚高脂血症组SREBP-2、LDL-R、HMGCR mRNA表达降低，同时相关蛋白表达量也呈现对应变化，从形态学上可以直观看到脾虚加重了病理变化。中医学认为脾虚的实质是脾失健运，“脾运化失司”久则表现为物质及能量转化障碍，进而出现体内的营养物质堆积而形成高血脂症。SREBP-2是一种存在于脊椎动物内质网内参与调节细胞TC代谢的转录调节物，可直接影响细胞膜上TC代谢水平，其可在TC含量降低的情况下，增进HMG-CoA还原酶、LDL受体等靶基因的表达，从而升高细胞内TC水平，从而调控TC及脂肪酸等脂类的代谢过程。SREBP-2作为一种特异的核转录因子主要参与TC合成酶的基因调控，常在固醇缺乏的情况下被激活，可以说此条通路对脂类TC代谢起到了重要的作用。TC在其中转化为胆汁酸是体内TC代谢的重要途径，CYP7A1是胆汁酸合成的限速酶，HMGCR是体内TC合成的限速酶，肝脏表面的LDL-R的功能是介导血浆中LDL-C的含量，可以通过此种方式来调节血浆含量和体内TC的水平。因此CYP7A1、HMGCR、LDL-R与SPEBP-2通路对TC代谢调节有密切关系。该实验结果显示脾虚高脂血症及高脂血症组的SREBP-2表达下降，脾虚高脂血症组下降更明显，这很可能由于脾虚引起的脾虚散精不利，血脂化生为痰浊，加重血脂的生成，TC调控通路受到影响，SREBP-2通道蛋白不能充足地吸收多余TC，TC增高又影响LDL-R受体表达降低，HMGCR的浓度受到TC的反馈调节，TC浓度升高会导致HMGCR浓度降低，从而使TC的生物合成减少，最终达到控制体内TC浓度的目的。化瘀祛痰方能显著提高CYP7A1、SREBP-2、LDL-R、HMGCR mRNA表达水平；同时降低TG、TC含量，提高AMY活性和D-木糖排泄率。提示健脾益气化瘀祛痰法对脾虚高脂血症具有一定的缓解作用，可能通过上调LDL-R的表达，促进CYP7A1转化TC为胆汁酸，激活SREBP2通道调控作用，从而降低血清TC水平，增加TC的逆转运。
（二）长链非编码RNA-NEAT1/miR-27b调控胆固醇代谢基因蛋白表达
孟嘉伟等围绕化瘀祛痰方调控长链非编码RNA-NEAT1/miR-27b对高脂血症大鼠胆固醇代谢的影响及机制开展了实验研究。化瘀祛痰方以党参、黄芪、绞股蓝为君，起健脾益气之用；以茯苓、半夏、菖蒲为臣，增燥湿化痰之功；以丹参、川芎、赤芍、郁金为佐使，强活血化瘀之效。诸药合用，“补不壅滞、通不损正”可以达到健脾益气，化痰祛瘀的功效。实验中32只SPF级健康SD大鼠适应性喂养2周后，随机分为正常组、模型组、化瘀祛痰方组和辛伐他汀组。正常组每日给予基础饲料，模型组、化瘀祛痰方组和辛伐他汀组每日给予高脂饲料（15%猪油，20%蔗糖，1.2%胆固醇，0.2%胆盐，0.2%甲基硫氧嘧啶，配合83.3%普通饲料），大鼠可以自由摄食，不限制饮水。8周后，除正常组外，其余3组继续喂饲高脂饲料，与此同时进行灌胃给药，按照人和动物的体表面积折算系数并换算给药剂量，给予化瘀祛痰方组13.846 g/（kg·d），给予辛伐他汀组1.575 mg/（kg·d），每日供给正常组与模型组等体积的生理盐水。给药4周后，先进行血脂检测，后取整个肝组织。全自动生物化学分析仪检测血清TG、TC、HDL-C和LDL-C的含量；采用HE染色观察肝脏组织病理变化，RT-qPCR法检测Lnc-NEAT1、miR-27b基因表达。RT-qPCR法与Western Blot法分别检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、肝X受体（LXR）、腺苷三磷酸结合盒转运体G5（ABCG5）、腺苷三磷酸结合盒转运体G8（ABCG8）基因及蛋白表达。
在正常人体内，胆固醇的吸收与合成呈现着动态平衡的关系，胆固醇的供应在细胞功能、组织发育和全身生理等方面产生积极影响。然而，现代医学发现，过量的胆固醇是导致血脂异常发生的重要原因。近年来，与维持脂质恒常性相关的核内受体、转录因子被阐明，它们可以通过感知细胞内的脂质浓度，或者将脂质作为直接配体进行应答的机制也被逐步揭示。PPARγ作为过氧化物酶体增殖物激活受体，在脂肪组织中拥有着高度的表达，能够参与调节胆固醇代谢以及脂肪细胞相应功能，是调节脂肪细胞分化以及干预储存脂质能力的重要因子，在全身脂质稳态的维持中具有关键意义。miR-27b在脂质水平的作用也被证实，可以控制多个对血脂异常有重要影响的基因。长链非编码RNA（LncRNAs）在脂肪生成；脂肪酸、胆固醇、磷脂代谢和转运；高密度和低密度脂蛋白（HDLs和LDLs）的形成中具有重要调控作用。通常作为微RNA（miRNAs）的前体RNA存在，或充当竞争性内源性RNA（CERNAs）与miRNAs发生相互作用。实验证实了LncRNA NEAT1对miR-27b具有抑制功能，Lnc-NEAT1可负调节miR-27b并作用于PPARγ受体参与脂质代谢。PPARγ调控下游基因，配体依赖性核受体家族中的成员LXR。并通过LXR编码参与甾醇代谢蛋白的基因ABCG5和ABCG8来增加胆固醇的排泄。ABCG5和ABCG8分布于肠细胞和肝细胞的根尖膜上，能够对肠道的吸收功能产生限制作用，并且对胆固醇和植物甾醇的胆汁分泌产生促进作用。LXR受体是ABCG5和ABCG8表达的主要阳性调节因子。ABCG5和ABCG8可以降低循环胆固醇和肝脏胆固醇的含量。在调控胆固醇代谢，防治高脂血症方面具有重要意义。该实验发现，高脂喂饲能够升高大鼠血脂，使肝细胞泡沫化明显。给予化瘀祛痰方干预后，大鼠血脂水平明显降低，说明化瘀祛痰方可改善血脂异常。经化瘀祛痰方干预后Lnc-NEAT1基因表达显著升高，miR-27b基因表达显著降低，PPARγ、LXR、ABCG5、ABCG8基因及蛋白表达均显著升高，说明化瘀祛痰方可能通过影响LnC-NEAT1/miR-27b/PPARγ纠正胆固醇代谢过程继而改善血脂水平。
（三）CircRNA-0067835调控胆固醇外排基因和蛋白表达
孟嘉伟等同时对香砂六君子汤调控CircRNA-0067835对脾虚高脂血症大鼠胆固醇外排的影响进行了实验研究。实验中对30只SD大鼠按照随机数字表法分为空白对照组、高脂组、脾虚高脂组、香砂六君子汤高剂量组及香砂六君子汤正常剂量组，每组6只。脾虚高脂组、香砂六君子汤高剂量组及正常剂量组大鼠建立脾虚模型，采用不节饮食加游泳至力竭的造模方法：饱食1天，禁食2天，不控制饮水；与此同时，每日放置大鼠于35～37℃水中游泳，直至力竭，连续15天。根据文献对大鼠脾虚证进行评估，当大鼠出现游泳耐力下降、体质量减轻、食量减少、粪便时软时溏、倦怠懒动、毛色枯槁无光泽等表现时，证明脾虚模型造模成功。随后建立高脂血症模型，除空白对照组外其余4组饲喂高脂饲料14周，期间自由摄食，不限制饮水。从建立高脂血症模型的第10周开始灌胃给药。根据前期研究以及香砂六君子汤人体的临床等效剂量换算，香砂六君子汤正常剂量组及香砂六君子汤高剂量组分别给予香砂六君子汤5.67g（kg·d）、11.34 g/（kg·d）灌胃，其他3组灌胃等体积的生理盐水，给药4周后取材。检测5组大鼠血脂水平。HE染色观察肝脏病理变化。qPCR法检测CircRNA-0067835、miR-155基因水平。qPCR及Western blot法检测PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA及蛋白表达水平。
胆固醇逆向转运是胆固醇代谢的关键部分，因而作为胆固醇逆向转运的起始步骤，胆固醇外排是抗血脂异常的关键机制之一。研究表明，PPARγ可参与胆固醇代谢和脂肪细胞功能的调控，在肝脏和骨骼肌中高度表达，可以通过对参与脂肪酸吸收/氧化和甘油三酯分解代谢的基因的转录调节，调控细胞内的脂质代谢，是治疗血脂异常的关键受体。CircRNAs是一类新的内源性非编码RNA，在真核转录组中有很高的表达。CircRNA“海绵”作用的发挥主要是通过miRNA，二者结合后，miRNA的作用受到抑制，从而影响下游基因表达。相关实验证实，CircRNA参与脂肪生成与脂解，可以调节脂肪组织的分化和转化。除此之外，CircRNA与巨噬细胞的脂质流出和脂肪分解有一定的关系，参与了脂质代谢的调节和脂质紊乱疾病的发展。实验证明，CircRNA-0067835可以抑制miR-155的表达并通过PPARγ参与胆固醇代谢。PPARγ调控下游基因LXR。LXR调节参与维持脂质稳态的多个基因的表达。研究表明，LXR激动剂对血浆高密度脂蛋白、胆固醇吸收和胆固醇逆向转运有益，是改善血脂异常的重要调节因子。PPARγ和LXR是在巨噬细胞胆固醇稳态中起关键作用的2个核受体，它们均与胆固醇排出的参与者ABCA1、ABCG1激活有关。LXR是控制细胞胆固醇运输的主要因子，通过直接增加ABCA1和ABCG1的水平，使得胆固醇可以从巨噬细胞中顺利泵出。ABCA1的主要任务是介导胆固醇向无脂的载脂蛋白A-Ⅰ（ApoA-Ⅰ）的外排，而胆固醇向高密度脂蛋白颗粒的外排是在ABCG1的参与下完成的。调控胆固醇外排在防治血脂异常方面具有重要意义。该实验发现，高脂饲喂的大鼠血脂升高，肝细胞可见显著泡沫化。而脾虚大鼠可见肝细胞更加显著的泡沫化，血脂水平也存在明显的变化，说明高脂血症大鼠在脾虚的病理状态下，脂质代谢紊乱程度将进一步加重。在香砂六君子汤的干预下，大鼠血脂水平得到改善。香砂六君子汤可能通过上调CircRNA-0067835水平，抑制miR-155基因表达，进而增加PPARγ、LXR、ABCA1、ABCG1 mRNA与蛋白表达水平，促进肝脏胆固醇外排，达到防治高脂血症的重要作用。
（四）胆固醇逆向转运相关基因蛋白表达
陈丝等围绕香砂六君子汤对脾虚高脂血症模型大鼠胆固醇逆向转运的影响开展了实验研究。40只SD大鼠普通饲料适应性喂养1周后，按体重采用随机数字表法分为正常对照组、高脂组、脾虚高脂组、香砂六君子汤正常剂量组及香砂六君子汤高剂量组，每组8只。脾虚高脂组、香砂六君子汤正常剂量组及香砂六君子汤高剂量组大鼠采用饮食不节加力竭游泳的复合方法造脾虚模型：饱食1天，禁食2天，饮水不限。同时，每日将大鼠于35～37℃水中游泳至力竭，连续造模15天。正常对照组喂饲基础饲料，其余各组喂饲高脂饲料14周建立高脂血症模型，自由摄食，饮水不限。于第10周灌胃给药，按人和动物体表面积折算系数换算，香砂六君子汤正常剂量组（人体临床等效剂量）及香砂六君子汤高剂量组分别给予香砂六君子汤5.67g（kg·d）、11.34 g/（kg·d）灌胃，正常对照组、高脂组及脾虚高脂组给予等体积的生理盐水灌胃，4周后取材。采用全自动生物化学分析仪检测血清TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。采用ELISA法检测血清中PLTP、LCAT、CETP含量，D-木糖试剂盒检测D-木糖排泄率。采用HE染色观察肝脏细胞形态变化。RT-PCR法检测肝脏PLTP、LCAT、CETP mRNA表达。
RCT（胆固醇逆转运）是机体维持脂质代谢平衡的主要途径，肝脏作为参与RCT的重要器官，可将胆固醇转化为胆汁酸并排出体外，维持机体正常脂质代谢过程。胆固醇外流是RCT起始阶段。首先，ABCA1可介导细胞内磷脂流出，而后与ApoA-Ⅰ结合形成磷脂-ApoA-Ⅰ复合物，该复合物可捕获细胞内通过扩散作用流出胆固醇，进而形成前β高密度脂蛋白（pre-β-HDL），在LCAT的作用下，将其转变为富含胆固醇酯的球状、成熟的HDL，进而促进HDL携带外周组织中过多的胆固醇随血液系统转运至肝脏。而PLTP可催化磷脂由其他脂蛋白转运至HDL，同时还可促进HDL介导的周围细胞内胆固醇及磷脂流出。CETP可将部分胆固醇酯由HDL转移至LDL、极低密度脂蛋白（VLDL）、中密度脂蛋白（IDL），再经肝脏表面LDL受体识别并降解。同时，HDL所含的剩余胆固醇酯可被肝脏表面SR-B1识别进而降解，继而实现胆固醇的水解及清除。当外源性胆固醇摄入过多，可通过上调CETP和PLTP表达水平，代谢过量的胆固醇，维持机体脂质代谢平衡。上调CETP表达可加快胆固醇酯转运速率，使大量胆固醇酯转运至肝脏，加速RCT进程。高水平表达的PLTP可促进β-HDL前体生成并提高肝脏摄取HDL能力，使HDL所携带的胆固醇酯更易被肝脏表面受体识别，进而加快胆固醇代谢速率。而LCAT低表达时将阻碍游离胆固醇转化为失去极性的胆固醇酯，使经HDL转运至肝脏的胆固醇酯数量减少，继而加重外周游离胆固醇的蓄积。该研究发现，高脂喂饲可使大鼠血脂升高，肝细胞泡沫化明显。脾虚状态下，大鼠尿D-木糖排泄率显著降低，大鼠血脂水平进一步升高，肝细胞泡沫化显著加重，说明脾虚可进一步加重高脂喂饲大鼠脂质代谢的紊乱程度。给予香砂六君子汤干预后，大鼠血脂水平降低，说明香砂六君子汤可纠正脾虚症状及改善血脂紊乱，虽然香砂六君子汤正常剂量和高剂量之间差异无统计学意义，但是从变化趋势仍可以看出香砂六君子汤高剂量作用可能更优。进一步探讨其机制发现，脾虚高脂组大鼠肝脏PLTP、CETP mRNA表达及血清中含量显著升高，可加速磷脂、胆固醇和胆固醇酯等物质转运至HDL及LDL，再经肝脏上的受体识别转运至肝脏，进而加快胆固醇代谢。而LCAT mRNA肝脏表达及血清中含量显著降低，可影响HDL成熟代谢过程，阻碍RCT进程，加重外周高胆固醇状态。经香砂六君子汤干预后，PLTP、CETP、LCAT mRNA表达及血清中含量显著改善，说明香砂六君子汤可能通过调控RCT相关基因及蛋白表达继而改善血脂水平。综上，脾虚状态可加重高脂血症大鼠脂质紊乱程度，香砂六君子汤可使脂质紊乱得以恢复、肝脏脂质沉积情况相对改善，其机制可能与调控RCT的PLTP、LCAT、CETP的表达密切相关。