从脾论治血脂异常与自噬相关研究
自噬（Autophagy）是真核生物中进化保守的对细胞内物质进行周转的重要过程。自噬作用是一种细胞自我降解的过程，以清除受损或多余的蛋白质和细胞器。当细胞代谢能量不足时，细胞依靠自噬作用实现细胞内成分的循环利用，从而维持自我稳态和生存。研究表明，自噬可以作为重要的调节因素参与脂质在肝细胞中的降解过程，通过包裹部分甚至整个脂滴的自噬体和溶酶体融合形成自噬溶酶体，并进一步分解脂肪成游离脂肪酸。在一定范围内，自噬水平上调可以有效降低脂质在肝细胞中的沉积。
（一）基于PCR array 技术检测自噬相关基因
孙艳梅等利用PCR array技术探讨化瘀祛痰方药对高脂血症大鼠肝脏mTOR介导自噬相关基因的影响。实验将30只SD大鼠随机分为正常对照组、高脂血症组、化瘀祛痰方组。正常对照组给予普通大鼠饲料喂饲，高脂血症组、化瘀祛痰方组予高脂饲料喂饲，造模60天后，化瘀祛痰组给予化瘀祛痰方煎剂10mL/次，1次/天，灌胃30天。全自动生化分析仪检测大鼠血清血脂水平，HE及油红O染色观察肝脏形态及脂质沉积情况，PCR array技术分析化瘀祛痰方对高脂血症大鼠肝脏mTOR介导自噬相关基因的影响。研究发现高脂血症组血脂（TC、LDL-C）含量升高，出现肝脏脂质沉积及脂肪空泡；化瘀祛痰方组血脂（TC、LDL-C）降低，肝脏脂滴减少。PCR array结果发现以mTOR为中心的不同作用途径基因Akt1、Bcl2、lgf1、Mapk14、Mapk8、Mtor、Becn1（brclin1）在3组比较发生差异性改变。该研究认为化瘀祛痰方可通过调控mTOR介导自噬相关基因使高脂血症大鼠肝脏自噬增强，改善高脂血症大鼠肝脏脂质损伤。
张妮等基于PCR array技术探讨了化瘀祛痰方对高脂血症大鼠肝脏自噬小体形成信号通路相关基因的影响。实验将30只SD大鼠随机分为空白对照组、高脂血症组、化瘀祛痰组，每组10只。采用高脂饲料喂饲法制备高脂血症模型后，化瘀祛痰组予化瘀祛痰方煎剂10mL/（kg·d），空白对照组、高脂血症组给予等体积的磷酸盐缓冲生理盐水灌胃。30天后检测大鼠血清血脂水平，HE及油红O染色观察肝脏形态变化及肝脏脂质沉积，PCR array筛选大鼠肝脏自噬小体形成信号通路的相关差异基因，Realtime PCR检测泛素样结合通路Atg12-Atg5通路和LC3-PE通路上的相关基因mRNA的表达水平。结果发现化瘀祛痰方对高脂血症大鼠的血脂和肝脏脂质沉积具有显著改善作用，PCR array结果显示，在参与自噬小体形成的基因中3组比较发生差异性改变的基因有10个。与空白对照组比较，高脂血症组Atg16l1、Atg3、Atg4c、Atg5基因mRNA表达水平均显著下降；与高脂血症组比较，化瘀祛痰组Atg16l1、Atg3、Atg4c基因mRNA表达水平均显著上升。结论化瘀祛痰方可能通过调节高脂血症大鼠肝脏自噬小体形成信号通路相关基因Atg16l1、Atg3、Atg4c、Atg5 mRNA的表达，从而改善高脂血症大鼠肝脏脂质损伤。
（二）AMPK/mTOR通路
孙艳梅等同时开展了化瘀祛痰方调控AMPK介导自噬对高脂血症大鼠肝脏脂质损伤的影响的实验研究。健康雄性SD大鼠32只，SPF级，体重（220±10）g，适应性饲养一周，按体重和血脂水平随机分为四组：空白组、高脂组、中药组、西药组，每组8只。采用高脂饲料喂饲造模法制备高脂血症大鼠模型，每日按时给予西方高脂饲料（含1%谷氨酸钠、6%蔗糖、8%花生油、5%蛋黄粉、1.5%胆固醇、78.1%基础饲料、0.4%甲基硫氧嘧啶）喂饲。经过造模12周，检测大鼠血清血脂水平进行模型评价。于后4周，中药组、西药组分别给予相应药物灌胃，正常组和高脂组给予等体积生理盐水灌胃，灌胃4周。Western blot技术检测各组大鼠LC3A/B、pmTOR、mTOR、p-AMPK、AMPK的表达水平。
AMPK为广泛存在真核细胞的Ser/Thr蛋白激酶，新近研究表明，在肿瘤细胞中，活化的AMPK和自噬反应密切相关。研究表明，AMPK激活后，可通过磷酸化TSC2肿瘤抑制因子及mTORC1的结合亚基raptor抑制mTORC1活性，诱导自噬发生。mTOR是一种重要的调节基因，是细胞内多种重要信号传导通路的调控蛋白，调控着细胞翻译起始、转录、蛋白合成及降解功能，进而调节细胞的生存、增殖和凋亡等细胞重要环节。mTOR是AMPK下游重要的信号分子，在生长因子、应激等情况下，mTORC1激活，通过磷酸化下游两个主要的靶点40S核糖体S6蛋白激酶（p70 ribosomal protein S6 kinases，p70S6K）和真核启动因子4E结合蛋白1（Eukaryotic initiation factor 4E bindingproteinl，4EBP1）发挥调节细胞生长和细胞增殖的功能；mTORC2能在能量消耗、生长因子等刺激因素下激活，参与细胞的周期、骨架与细胞存活等生理过程。AMPK激活后可通过3种途径来抑制mTOR活性：①AMPK活化后，通过TSC2激活TSC1/2，进而抑制小GTP酶Rheb，负向调控mTOR功能。②AMPK磷酸化联接蛋白raptor，增加其与14-3-3蛋白结合的能力，从而通过阻碍raotor与mTOR或mTOR与底物的结合，抑制mTOR。③AMPK可以通过直接磷酸化mTOR并导致自身磷酸化水平下降。该研究结果发现与高脂组相比，中药组LC3A/B、p-AMPK蛋白表达水平明显增高，p-mTOR蛋白表达水平明显降低。说明化瘀祛痰方能够通过调控AMPK/mTOR通路，增强高脂血症大鼠肝脏自噬水平，即化瘀祛痰方可通过调控AMPK介导自噬相关基因，使高脂血症大鼠肝脏自噬增强，改善高脂血症大鼠肝脏脂质损伤。
（三）PI3K/AKT/mTOR信号通路
1.体内实验研究
曹媛等对化瘀祛痰方药调控PI3K/AKT/mTOR信号通路改善高脂血症大鼠肝脏脂质代谢的机制进行了实验研究。实验将40只SPF级雄性SD大鼠随机分为正常组、高脂血症组、化瘀祛痰方组及血脂康组（n=10）。正常组予正常饲料，其他组予高脂饲料，60天后化瘀祛痰方组、血脂康组分别给予相应药物灌胃，其他组给予等体积磷酸盐缓冲0.9%氯化钠溶液灌胃30天。HE与油红O染色观察大鼠肝脏形态变化；全自动生化分析仪检测血清血脂水平；Western Blot检测肝脏PI3K/AKT/mTOR通路蛋白表达。mTOR是细胞生长及增殖的重要调节因子，能够调节多种生理环节，如蛋白质合成和降解、能量代谢、自噬、转录等。研究表明它在脂代谢过程发挥着重要的调节功能。mTOR是自噬过程的重要调控因子，mTOR的磷酸化可通过清除泛素蛋白进而抑制细胞自噬过程。PI3K/AKT/mTOR通路是经典的自噬通路，AKT是PI3K的下游效应子，同时是mTOR上游的重要调控分子。LC3是检验自噬是否发生的关键蛋白。实验结果表明，化瘀祛痰方能够显著下调高脂血症大鼠肝脏PI3K、p-AKT、p-mTOR，增强肝脏自噬蛋白LC3A/B的表达。综上所述，化瘀祛痰方能有效调节血脂，改善肝脏脂质沉积，其作用可能与调节PI3K/AKT/mTOR通路，增强自噬有关。该研究以“自噬”为切入点，分析高脂血症大鼠肝脏PI3K/AKT/mTOR通路自噬相关基因表达变化及化瘀祛痰方的干预作用，从调控自噬层面为临床“痰瘀论治”血脂异常提供实验依据。
2.体外实验研究
刘晶晶等通过研究发现，化瘀祛痰方通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路减轻油酸和棕榈酸引起的HepG2细胞脂质沉积。实验使用含100mL/L FBS、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素的DMEM培养基，在37℃、50mL/L CO2条件下培养HepG2细胞。每24小时换液1次，细胞汇合达80%～90%时，用2.5g/L胰蛋白酶消化收集细胞并传代。化瘀祛痰方含药血清制备：将20只成年雄性SD大鼠，随机分为正常对照组和化瘀祛痰方组，每组10只。药物按其临床等效剂量的10倍进行灌胃，空白对照组给予等量的生理盐水。每日给药2次，连续给药7天，于末次灌胃后2小时（灌药前禁食不禁水12小时），进行腹主动脉采血，2500r/min离心30min，分离血清。合并各组含药血清，在56℃恒温水浴锅中灭活后，超净工作台内用0.22μm微孔滤膜过滤后分装，-80℃保存备用。实验共分5组。正常对照组：100mL/L大鼠空白血清的DMEM完全培养基培养；模型组：100mL/L大鼠灭活血清预培养至细胞长满瓶底70%～80%时，加入终浓度1mmol/L的油酸和棕榈酸混合液（摩尔比2∶1），分别诱导6小时、24小时；LY294002处理组、化瘀祛痰方联合LY294002处理组先分别用100mL/L大鼠空白血清和化瘀祛痰方含药血清培养过夜后，加入20μmol/L的LY294002预处理30分钟后，LY294002组继续用100mL/L大鼠空白血清的DMEM完全培养基培养；化瘀祛痰方处理组和化瘀祛痰方联合LY294002处理组继续用100mL/L化瘀祛痰方含药血清培养，而化瘀祛痰方组一直用100mL/L的化瘀祛痰方含药血清培养。待3组细胞汇合度达70%～80%时，加入1mmol/L的油酸和棕榈酸混合液分别诱导6小时、24小时，进行各项指标的检测。油红O染色观察HepG2细胞内脂滴沉积情况，全自动生化分析仪检测HepG2细胞TG含量，免疫荧光细胞化学染色检测HepG2细胞LC3B的表达，Westernblot法检测各组HepG2细胞p-AKT、p-mTOR、LC3A/B、SREBP-1c蛋白水平。mTOR是调节细胞生长、增殖及自噬等上游通路的靶点，PI3K/AKT通路的下游效应分子，mTOR活性是自噬体形成和成熟的关键。PI3K共分为3种类型，其中与AKT/mTOR自噬相关的是Ⅰ型，Ⅰ型PI3K活化时AKT/mTOR信号通路被激活，抑制细胞自体吞噬，Ⅲ型PI3K活化时激活beclin-1启动自噬进程。本研究以油酸和棕榈酸混合物诱导HepG2细胞建立脂肪沉积模型；以化瘀祛痰方的大鼠含药血清和PI3K抑制剂LY294002进行干预，探讨化瘀祛痰方能否通过抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路诱导HepG2细胞发生自噬从而减轻油酸和棕榈酸对HepG2细胞造成的脂质沉积。与模型组相比，发现化瘀祛痰方组的p-AKT、p-mTOR蛋白表达显著减低，相反自噬标志性抗体LC3B蛋白的表达显著升高；说明化瘀祛痰方可能主要抑制Ⅰ型PI3K而发挥诱导自噬的作用；LY294002组除显著降低p-AKT、p-mTOR蛋白外，LC3B蛋白的表达量也随之降低，说明LY94002可能主要抑制Ⅲ型PI3K；化瘀祛痰方联合LY294002组虽然也显著抑制p-AKT、p-mTOR蛋白表达量，但却增强LC3B蛋白的表达，说明化瘀祛痰方药可能部分拮抗了抑制剂LY294002对Ⅲ型PI3K的阻断作用。化瘀祛痰方可减轻油酸和棕榈酸对HepG2细胞造成的脂滴沉积，其降脂机制可能与抑制PI3K/AKT/mTOR信号通路上p-AKT和p-mTOR蛋白低表达而诱导HepG2细胞发生自噬有关。