从脾论治AS与炎症机制相关研究

（一）体内实验研究

AS是以脂质沉积血管为主的慢性疾病，研究表明免疫炎症反应在AS的发生发展中具有重要作用。在AS病变初期，内皮细胞损伤、脂质代谢障碍等均可介导动脉血管内皮炎症改变。活化后的内皮细胞释放大量趋化因子及细胞因子等，进而招募血液中单核细胞进入组织转化为巨噬细胞。巨噬细胞吞噬脂质并释放大量炎症因子后转化为泡沫细胞堆积于动脉管壁，逐渐形成粥样斑块。动脉斑块处细胞能量代谢变化与AS斑块进展及稳定性密切相关。磷酸戊糖途径（Pentose phosphate pathway，PPP）关键酶葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（Glucose-6-phosphate dehydrogenase deficiency，G6PD）水平升高激活PPP可能会促进斑块炎症反应的发生，并加速AS的发展。殷晓梅等围绕化瘀祛痰方对ApoE-/- AS小鼠主动脉G6PD/NF-κB表达及炎症水平的影响开展了实验研究。实验将24只ApoE基因敲除（ApoE-/-）小鼠随机分为模型组、化瘀祛痰方组、辛伐他汀组，给予高脂饲料喂养12周。选用8只C57BL/6J小鼠作为空白组，给予普通饲料喂养。化瘀祛痰方组以及辛伐他汀组分别给予相应的药物灌胃，空白组与模型组给予等量的生理盐水。4周后采用ELISA检测血脂；采用HE染色观察主动脉斑块形态学改变；Elisa法检测血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平；Western blot法及实时荧光定量Q-PCR法检测主动脉IL-6、IL-1β、TNF-α、G6PD、NF-κB蛋白及mRNA的表达。

辽宁中医药大学杨关林教授长期致力于探究AS疾病临床治疗以及中医药对AS疾病的科研机制，并发明专利方：化瘀祛痰方，由党参、绞股蓝、黄芪、茯苓、郁金、法半夏、丹参、川芎、石菖蒲九味中药组成，具有益气健脾，化痰祛瘀之功效。化瘀祛痰方在临床治疗AS疾病中具有良好的疗效。该实验研究发现，化瘀祛痰方可以有效改善ApoE-/-AS小鼠血脂水平，有效抑制ApoE-/-AS小鼠斑块进展，延缓AS的发生与发展。G6PD是PPP的限速酶，G6PD调控PPP产生5-磷酸核糖，为核苷酸、核酸的合成提供原料。其产生的NADPH亦是细胞内抗氧化系统所必需物质，能够清除细胞内过多的活性氧（Reactive oxygen species，ROS），对细胞生长及生理功能至关重要。G6PD过表达能够激活NF-κB信号通路，引起细胞内氧化应激和促炎性细胞因子的表达，若使用化学抑制剂或小干扰RNA抑制G6PD表达可显著减少NF-κB蛋白表达，降低IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子表达，从而抑制AS的发生与发展。美国哈佛大学Paul MRidker教授研究发现IL-1β单克隆抗体用于三期临床试验，可显著减少AS疾病的发生。可见降低AS斑块处IL-1β等炎症因子反应对防治AS发生与发展具有重要意义。化瘀祛痰方能够降低主动脉斑块处G6PD、NF-κB蛋白及mRNA水平，并降低斑块及血清中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的表达。提示化瘀祛痰方能够减小主动脉斑块大小，延缓AS进展，其机制可能与其调控G6PD/NF-κB表达，降低G6PD、NF-κB蛋白水平、抑制炎症反应有关。

冷雪等围绕AS小鼠肝脏脂质代谢相关的PPAR-γ/LXR-α/ABCG1通路及炎症因子的变化和化瘀祛痰方在其中的作用开展了实验研究。PPARs是调节脂质代谢的重要转录调节因子，PPAR-γ是PPARs家族成员之一，作为一种重要的核受体转录因子，可与配体结合并激活启动下游一系列参与脂质代谢的基因表达，包括可以通过LXRs参与调控下游ABCA1/ABCG1，从而起到介导胆固醇流出的作用，此外PPAR-γ还参与对炎症反应的调控。TLR4是Toll样受体家族的重要成员之一，作为关键的免疫反应信号转导受体可参与对炎症反应的调控作用，从而影响AS的发生发展等多个环节。实验将24只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、化瘀祛痰方组和辛伐他汀组，8只C57BL/6J小鼠作为正常对照组。除正常对照组给予基础饲料外，其余各组给予高脂饲料。造模12周后，灌胃给药，化瘀祛痰方组与辛伐他汀组给予相应药物，正常对照组与模型组给予等体积的生理盐水。8周后检测血脂水平与肝脏组织形态学变化以及脂质沉积情况；ELISA法检测肝脏游离脂肪酸（FFA）、TG、TNF-α、TLR4和IL-1β的含量；Western blot法检测PPAR-γ、LXR-α和ABCG1的蛋白表达。实验结果显示化瘀祛痰方在一定程度上可以降血脂、改善肝脏脂质沉积。同时，模型组小鼠肝脏内PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白表达明显降低，化瘀祛痰方组小鼠肝脏内PPAR-γ、LXR-α和ABCG1蛋白表达升高，提示化瘀祛痰方可能通过调控肝脏PPAR-γ/LXR-α/ABCG1通路及减弱肝脏TRL4介导的炎症反应来达到抗AS的作用。

（二）体外实验

贾连群等围绕化瘀祛痰方药及其拆方含药血清对脂多糖诱导的人脐静脉内皮细胞炎症因子表达的影响开展了实验研究。SD大鼠随机分为空白对照组、全方组、补气组、化瘀组、祛痰组，生理盐水和相应中药予以灌胃，第9天腹主动脉采血，分离血清。体外培养EA.hy926细胞，随机分为：①正常对照组。②LPS刺激组。③全方组。④补气组。⑤化瘀组。⑥祛痰组。⑦空白血清对照组。其中②组加入终浓度为10 mg/L LPS，③～⑦组用相应含药血清（浓度为10%）预处理24小时后加入终浓度为10 mg/L LPS，各组细胞培养24小时后进行各项指标测定。RT-PCR法检测NF-κB和TNF-αmRNA表达；ELISA法检测TNF-α蛋白的表达；免疫荧光细胞化学法检测NF-κB蛋白的表达。LPS存在于革兰阴性细菌细胞壁外膜，是革兰阴性细菌诱发炎症的主要因子。目前认为，LPS刺激信号在靶细胞信号传导通路为：TLR4→胚胎蛋白MyD88→IRAK→IκB→NF-κB，进而诱导TNF-α，IL等的表达，上述途径被称为TLR4/NF-κB信号通路。TNF-α是TLR4/NF-κB信号通路中的下游信号分子，表达量的多少可以直接反映炎症的严重程度，该研究发现化瘀祛痰全方及拆方化瘀药能显著下调LPS诱导的NF-κB，TNF-α的表达，提示抑制TLR4/NF-κB信号通路活化可能是化瘀祛痰方药发挥抗炎作用进而干预AS发生、发展的机制之一。