循环系统机能学研究方法
循环系统机能学评价指标主要包括心肌电生理、心脏泵血功能、血流动力学、微循环等。这些都是正常、疾病状态(疾病模型)及中医药干预后循环系统功能评价不可缺的指标。
(一)心肌电生理
心脏的基本活动形式包括心脏的电活动和机械活动,在每个心动周期中都是电活动在前,机械活动在后,形成了兴奋与收缩的耦联。心脏电活动的障碍、急剧紊乱、心电衰竭直接影响着心脏的机械活动和泵功能,均可引起血流动力学的改变,严重者可使心输出量降为零,造成猝死。因此,对心脏电活动的检查、研究日益受到重视。
随着电子学、工程物理学、电子计算机学在医学领域中的渗透,使心脏电生理检查诊断技术迅速进展,出现了细胞电生理学、实验心脏电生理学、临床心脏电生理学。检查方法学方面,新的实验诊断技术不断出现,使研究水平显著提高。理论方面,细胞膜离子通道理论的进展和程序性心脏刺激技术的应用,使临床心脏电生理理论上出现了巨大的更新和突破性进展。目前,心脏电生理学与心电图学、心音图学、超声心动图学、心脏核医学一样,已成为心血管病学科中十分重要的一门独立的诊断学科,成为心血管病一项不可缺少的检查诊断方法。
1.心肌细胞电生理检测
心肌细胞电生理研究的进展,不但促进了对心脏生理功能和心律失常发生发展规律的深入了解,而且对于抗心律失常药物作用的机制阐明及其合理应用亦有重要意义。膜片钳技术和细胞内微电极技术是心肌细胞电生理的常用检测技术。
应用微电极测定在体心肌细胞动作电位,是对心律失常、缺血性心脏病及药物对心肌细胞电活动调节的细胞水平研究的重要方法。
膜片钳技术是用一个尖端玻璃微电极(尖端直径在1.5~3.0μm)接触细胞膜表面,通过负压吸引使电极尖端与细胞膜之间形成千兆欧姆以上的阻抗封接,此时电极尖端下的细胞膜小区域(膜片,Patch)与其周围在电学上分隔,在此基础上固定(钳制,Clamp)电位,对此膜片上的离子通道的离子电流进行监测及记录。它是一种以记录通过离子通道的离子电流来反映细胞膜单一的或多个的离子通道分子活动的技术。膜片钳技术被称为研究离子通道的“金标准”,广泛应用于神经(脑)科学、心血管科学、药理学、细胞生物学、病理生理学、中医药学、植物细胞生理学、运动生理学等多学科领域研究,在药物研发、药物筛选中显示了强劲的生命力,目前膜片钳技术已从常规膜片钳技术发展到全自动膜片钳技术。在膜片钳技术的发展过程中,主要形成了几种记录模式,如细胞吸附式膜片、内面向外式膜片、外面向外式膜片、全细胞式膜片和穿孔膜片。
(1)细胞吸附式膜片(Cell attached patch):这种模式是膜片钳的基本方式,其他方式由此衍生。这种膜片形式最大的优点是维持了完整的细胞骨架及有关代谢过程,对细胞结构和环境干扰最小。但这种膜片形式易在电极尖端形成囊泡,易引起细胞骨架发生变化,另外这种形式无法控制细胞内成分,且任何影响膜电位的处理均可影响其电位水平。
(2)内面向外式膜片(Inside out patch):这种膜片细胞内外和电极内的溶液都可以调控,既能改变细胞内离子或物质的浓度,又能把酶等物质直接加于膜的内侧面,适宜研究细胞内物质对离子通道活动的影响。因难以改变膜外侧物质,且需浸于低钙液中,因此这种膜片形式常用于研究依赖细胞内钙离子的通道,如钙敏感的钾通道,以及用于细胞内激素和第二信使与通道的调节作用。
(3)外面向外式膜片(Outside out patch):这种形式的膜片能接触细胞膜的两侧,可以调整膜外物质的浓度,常用于研究细胞膜外侧受体控制的离子通道。因细胞外液容易更换,故加药方便。缺点是实验中难以改变胞内成分,而且电极管内必须是低钙液。
(4)全细胞式膜片(Whole cell patch):全细胞式膜片方式可以大大减少细胞内与浴槽之间的漏流。电极本身阻抗(1~10MΩ)远远低于细胞封接后的阻抗,这种低接触阻抗使得单管电压钳变得容易实现。另外,电极管内与细胞之间弥散交换与平衡速度较快,因而可以比较容易控制细胞内液的成分。一般情况下,细胞钳记录的是多种通道的平均电流,有利于综合分析。如果事先将膜电位钳制在某一程度,可做到有选择性地抑制某些离子通道的活性而只记录某种通道电流的总和,并可以在同一细胞上观察几种不同通道的电流变化情况。通过改变内部介质,如改变电极内液成分,或在电极内液中加入实验药物,通过渗透很快就可以改变胞浆成分并达到平衡,该手段在全细胞记录中被广泛应用。它适合于小细胞的电压钳位,但对于直径大于30μm的细胞就比较难实现钳制。全细胞式膜片最大的不足之处是电极与细胞间交换快,细胞内环境很容易被破坏,因此记录所用的电极液应与胞浆主要成分要尽可能相同,如高K+、低Na+和Ca2+及一定的缓冲成分和能量代谢所需的物质。
(5)穿孔膜片(Perforated patch):穿孔膜片最大的优点是克服了常规全细胞模式的胞质渗漏问题,常见的做法是将与离子亲和的制霉菌素或两性霉素B经微电极灌流到含有类甾醇的细胞膜上,形成只允许一价离子通过的孔,采用这种方法在膜片上做很多导电性孔道,借此对全细胞膜电流进行记录。由于此模式的胞质渗漏极为缓慢,局部串联阻抗比常规全细胞模式高很多,所以钳制速度比较慢,因此,也称为缓慢全细胞模式。
2.动物心电图描计
心电图(Electrocardiogram,ECG)是利用心电图机从体表记录心脏每一心动周期所产生电活动变化的曲线图形。心脏是人体血液循环的动力装置。正是由于心脏自动不断地进行有节奏的收缩和舒张活动,才使得血液在封闭的循环系统中不停地流动,使生命得以维持。心脏在搏动前后,心肌发生激动。在激动过程中,会产生微弱的生物电流。这样,心脏的每一个心动周期均伴随着生物电变化。这种生物电变化可传达到身体表面的各个部位。由于身体各部分组织不同,距心脏的距离不同,心电信号在身体不同的部位所表现出的电位也不同。对正常心脏来说,这种生物电变化的方向、频率、强度是有规律的。若通过电极将体表不同部位的电信号检测出来,再用放大器加以放大,并用记录器描记下来,就可得到心电图形。由于心肌细胞自发电兴奋活动,导致心脏的机械性收缩和舒张,与此同时,心脏在兴奋过程中产生的微小生物电可经过人体组织传导到体表。如果将测量电极放置的在人体表面的一定部位,连接到一个装有放大和描记装置的心电记录仪上,记录出来的每一心动周期的心脏电位变化的连续曲线,就是临床常用的体表心电图。
(二)心脏泵血功能
超声波是由压电晶体将电能转化为声能而生成的,同时可作逆向转换。这些晶体的振动频率在医学应用中一般为2~10MHz,比可听声波频率(最大20kHz)高很多。超声波扫描原理与雷达和声呐很相似。发出脉冲声波,测量多层反射回声的能量和到达时间,主要是测定超声波源和反射体之间的距离。当回声被适当显示时,即可获得研究区域的解剖图像。动物体结构对超声而言就是一个复杂的介质,各种器官与组织(包括病理组织)有它特定的声阻抗和衰减特性,因而构成声抗和衰减的差异。超声射入体内,由表面到深部,将经过不同声阻抗和不同衰减特性的器官与组织,从而产生不同的反射与衰减。这种不同的反射与衰减是构成超声图像的基础。将接收到的回声,根据回声强弱,用明暗不同的光点依次显示在荧屏上,则可显出动物体的超声图像。由于探查目的和方法不同,超声诊断仪的结构也不同,目前主要有3种类型:A型(幅度调制型)、B型(灰度调制型)、M型(移动型)等。
超声心动图是心脏泵血功能常用检测技术,其评价指标包括:心动周期(心脏每收缩并舒张一次所需时间)、心率(单位时间内心脏搏动的次数)、每搏输出量(一侧心室每搏动一次所射出的血液量)、射血分数(每搏输出量占心室舒张末期容积的百分比)、每分输出量(每分钟由一侧心室输出的血量)、心脏指数(安静和空腹状态下每平方米体表面积的心输出量)和每搏功等。
(三)血流动力学研究
血液循环是一个闭合的系统,在这个系统中,血液作为一种流体,在心脏的推动下在心血管系统中循环流动。血液循环除受心脏泵出的血量影响外,还受其他一些因素的影响和制约,如流动物质的特质及数量、系统内部的压力、对压力的阻力、流动的速度、流动的类型、系统适应变化的能力等。精确的血流控制来自心脏的输出、肾脏对多余水分、电解质的排泄、荷尔蒙和神经系统等因素的交互作用。血流动力学基本的研究对象是流量、阻力和压力之间的关系。由于血管是有弹性和可扩张性的,血液含有血细胞和胶体物质等多种成分的液体,因此血流动力学除与一般流体力学有共同点外,又有其自身的特点。
血压是重要的血流动力学生理指标,动物血压的测量方法与技术是机能实验的基本技能之一,也是心血管生理学、药理学研究所必备的实验技术之一。动物实验中常用有创动脉血压测量和心脏射血检测技术。血压的测量方法分为直接测压法和间接测压法。直接测压法即利用动脉插管来实现测血压的方法;间接测压的方法较多,如鼠尾容积测压法、鼠尾传感器测压法、鼠尾搏动投影测压法、鼠脚测压法、颈部皮桥测压法等。测定指标:动脉收缩压(SBP)、舒张压(DBP)、平均动脉压(MBP)、左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)等指标。
(四)微循环机能学检测
微循环(Microcircalation)系指毛细血管中的血液循环,与大循环相比,其具有血管数量多、分布广的特点,因此其对各种生理或病理因素的变化都十分敏感。微循环观测无创、安全、易行,随着科技的高速发展,近年来发展迅速。随着微循环研究的深入开展,人们对微循环的认识也有了本质的区别。目前认为,广义的微循环应包括体内3个体液循环系统:血液微循环系统,即微动脉与微静脉之间微血管中的血液循环;淋巴液微循环系统;组织液微循环系统或超微循环系统。由于在研究中不借助染料造影等特殊技术,不能活体观察组织液和淋巴液的动态变化,因此目前的研究对象主要看重于血液微循环,并且往往将其简称为微循环。应用现代医学研究方法深入探讨中医血瘀本质和活血化瘀原理时,发现血瘀是一个与血液微循环障碍密切相关的病理过程,不少活血化瘀的中草药,如丹参、川芎、益母草、当归、红花、蒲黄等都具有改善微循环障碍的作用。因此,各种研究微循环的方法已成为进行活血化瘀药物药理研究的有效手段。
需应用医学显微图像分析系统,观察指标有:微血管管径(反映微血管的扩张和收缩程度)、微血流速度(在一定程度上反映微循环的灌流状态)、流态(反映血流速度和红细胞聚集状态,常将红细胞流态分为4级:直线状、虚线状、粒状和淤滞状)、毛细血管网交点计数(反映毛细血管充盈情况)、血色(反映含氧及供氧情况)和微血管周围变化(主要观察有无渗出和出血情况,以反映微血管通透性和完整性)。