细胞培养与细胞工程技术
生物体是一个高度统一的整体，而细胞生物学的主要对象是生物体内的各种细胞，很显然，在整体条件下研究单个细胞或某一细胞群在体内（In vivo）的功能活动是非常困难的。在实际工作中，人们常常从生物体内取出组织或细胞，在体外（In vitro）模拟体内生理环境，在无菌、适当温度和一定营养条件下，对这些组织或细胞进行孵育培养，使之保持一定的结构和功能，以便于观察研究，这种方法就是细胞培养（Cell culture）。
细胞培养的工作始于20世纪初，目前已广泛应用于生物学、医学的各个领域。细胞培养主要具有两个方面的优点，其一是人工培养条件易于改变并能严格控制，便于研究各种因素对细胞的结构、功能和各种生命活动规律的影响；其二是细胞在体外培养环境中可以长期存活和传代，因此可以比较经济地、大量地提供在同一时期、条件相同、性状相似的细胞作为实验样本。
细胞培养技术也存在着一定局限性，主要是细胞离体以后失去与体内环境的密切联系，失去了神经体液的调节和不同细胞间的相互作用，特定分化基因的表达减弱或停止，而进化中保守的细胞生长和增殖活动却可维持，遂使体内外细胞出现了差异，这是应用细胞培养技术应该注意的问题。
（一）细胞培养的基本技术
1.细胞分离和原代培养
原代培养也叫初代培养，指从供体取得组织，分离得到所需细胞后接种于培养瓶，进行首次培养。培养材料为血液、羊水、胸水和腹水等细胞悬液时，可采用低速离心法分离。培养材料为组织块时，首先要把组织块剪切至尽量小，然后用胰蛋白酶或胶原酶消化法使组织进一步分散，以获得细胞悬液后予以接种。
2.培养细胞的传代
贴壁细胞的消化传代多用混合了胰蛋白酶和二乙烯四乙酸二钠（EDTA）的消化液消化传代。EDTA能从组织生存环境中吸取Ca2+、Mg2+，这些离子是维持细胞黏附于细胞外基质的重要因素。消化液使细胞脱落形成细胞悬液，然后以合适比例接种在新的培养瓶内，悬浮细胞的传代可直接添加新鲜培养液，或离心收集后换新鲜培养液，以一定比例稀释传代。
3.细胞的冻存和复苏
培养细胞的长期保存需要将细胞冻存，在需要再次培养的时候再行复苏。冻存前需向培养基中加入保护剂甘油或二甲基亚（DMO），以减少冰晶对细胞的损伤。细胞冻存与复苏的原则是“慢冻快融”。从理论上讲，细胞冻存在液氮中的贮存时间是无限的。
4.细胞培养微生物污染的检测
细胞培养过程中操作不当时，易引发微生物污染，主要污染微生物为霉菌、细菌和支原体。可用多种手段明确污染性质，从而从源头上杜绝污染，然而微生物污染一旦发生，多数无法救治。为了防止污染的蔓延，应及时丢弃污染细胞。
（二）细胞工程
细胞工程是细胞生物学与遗传学的交叉领域，主要利用细胞生物学的原理和方法，结合工程学的技术手段，按照人们预先的设计，有计划地改变或创造细胞遗传性的技术。细胞工程所使用的技术主要是细胞培养技术、细胞分化的定向诱导技术、细胞融合技术、单克隆抗体技术、细胞重组技术、显微注射技术、染色体工程技术和基因工程技术等。利用这些技术可以从细胞水平、核质水平、染色体水平及基因水平等不同层次将细胞加以改造，在中医药研究中，细胞工程技术可用于研究动植物细胞与组织培养、细胞融合、细胞核移植、染色体工程、胚胎工程、转基因生物与生物反应器等及其中医药的调控作用等。
1.细胞融合技术
在细胞自然生长情况下，或在其他人为添加因素存在下，使同种细胞之间或不同种类细胞之间相互融合的过程，即为细胞融合（Cell fusion），通过细胞融合，可将来源于不同细胞核的染色体结合到同一个核内，结果形成一个合核体的杂种细胞。在实际工作中常采用包括病毒类融合剂如仙台病毒、化学融合剂如聚乙二醇（PEG）及电击融合法等各种促融合手段。在进行细胞融合反应和适当时间的培养后，需要通过一定方法对两种亲本细胞融合产生的具有增殖能力的杂种细胞进行筛选。筛选方法主要包括药物抗性筛选、营养缺陷筛选和温度敏感性筛选等。细胞融合最典型的应用是单克隆抗体技术，细胞融合技术的发展和骨髓瘤细胞株的建成促成了B细胞杂交瘤技术的建立和单克隆抗体技术的成功。
2.核移植技术
细胞核移植（Nuclear transfer）是指将一个双倍体的细胞核（可来自胚胎细胞或体细胞）移植到去核的成熟卵母细胞或受精卵中。重组的卵细胞可以植入母体，并能发育为与供核细胞基因型相同的后代，因此又称为动物克隆技术。1997年诞生的克隆羊“多利”就是体细胞核移植技术的产物。核移植技术首先是选取合适的受体去核卵细胞和供体核。将获得的核转移到已经人工去核的成熟卵母细胞卵周隙后，施加微电流脉冲，使核质融合，形成一个重组卵。重组卵需经一定时间的体外培养，或放入中间受体动物输卵管内孵育，经过一段时间的培养，有的动物需形成桑椹胚或囊胚，再植入受体子宫里。
3.基因转移技术
基因转移（Gene transfer）指向受体细胞中导入外源基因，是改造细胞遗传性状的常用手段。一般情况下，能稳定接纳外源基因的细胞只有受体细胞总数的千分之几。因此为了快速有效地筛选转化细胞，一般在转入基因中携带有特定的选择标记，目前应用较多的为细胞抗药性筛选，如根据新霉素抗性基因进行筛选。基因转移又常称为基因转染（Gene transfection）。
（1）物理学方法：包括电穿孔、显微注射、裸露DNA直接注射等。
电穿孔法利用脉冲电场提高细胞膜的通透性，在细胞膜上形成纳米大小的微孔，使外源DNA转移到细胞中，该方法较为简单，广泛应用于培养细胞的基因转移。
显微注射法主要用于制备转基因动物。该法的基本操作程序是：通过激素疗法使雌鼠超数排卵，并与雄性小鼠交配，然后从雌鼠输卵管内取出受精卵；借助于显微镜将纯化的DNA溶液迅速注入受精卵中变大的雄性原核内：将注射了基因的受精卵移植到假孕母鼠输卵管中，繁殖产生转基因小鼠。该方法转入的基因随机整合在染色体DNA上，有时会导致转基因动物基因组的重排、易位、缺失或点突变。
裸露DNA直接注射法是最简单的基因转移方法。将裸露DNA直接注射到组织后，DNA有可能直接被细胞所摄入。外源基因进入细胞的效率与局部组织或细胞的损伤程度有关，基因在体内的表达时间与机体的免疫功能有关。
（2）化学方法：包括DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀、脂质体法等，这些方法多用于培养细胞的基因转移，是通过增加细胞膜的通透性、增加胞吞或胞饮、增加DNA与细胞的吸附等机制而实现基因转移的。
DEAE葡聚糖法将外源DNA片段与DEAE-葡聚糖等高分子碳水化合物混合，形成含DNA的大颗粒黏附于受体细胞表面，通过其胞饮作用进入细胞内，这种方法的转染效率较低。磷酸钙共沉淀法是使DNA与磷酸钙共沉淀形成大颗粒，颗粒悬液与细胞一起孵育，颗粒通过胞饮作用进入细胞。该方法转染效率至少是DEAE葡聚糖法的100倍。脂质体（Lipofectin）法令脂质体试剂与DNA作用，将DNA分子包入其囊状结构中，携带了DNA的脂质体可与受体细胞膜发生融合，DNA片段随即进入细胞质和细胞核内。该方法基因转移效率很高。
（3）生物学方法：主要指病毒介导的基因转移。根据受体细胞类型的不同，可选择使用具有不同宿主范围和不同感染途径的病毒基因组作为转染载体。目前常用的病毒载体包括DNA病毒载体（腺病毒载体、猴肿瘤病毒载体、牛痘病毒载体）、反转录病毒载体等。用作基因转导的病毒载体都是缺陷型的病毒，感染细胞后仅能将基因组转入细胞，无法产生包装的病毒颗粒。这种方法的缺点是：所有的病毒载体都会诱导产生一定程度的免疫反应；都或多或少地存在一定的安全隐患。