聚合酶链式反应技术（PCR技术）

聚合酶链式反应技术（Polymerasechainreaction，PCR）是根据体内DNA半保留复制原理设计的一种体外基因扩增技术，类似于体内DNA的天然复制过程，是在DNA聚合酶的催化下，利用一对人工合成的寡核苷酸引物和4种脱氧核苷三磷酸对目标基因进行特异体外扩增的过程。PCR技术在中医药实验研究和临床检测中已得到广泛的应用。如可用于检测与恶性肿瘤发生有关的突变基因及中医药的干预调节效应，可用于中医不同治法对信号通路多基因表达差异的研究，研究中医常用处方及配伍的疗效及其分子机制等。在中药鉴定上，PCR技术能以其准确无误、迅速、简捷检测结果，鉴定中药材的道地性及品质等。PCR的基本反应步骤包括：①变性：将反应体系加热至95℃，使模板DNA完全变性成为单链，同时引物自身以及引物之间存在的局部双链也得以打开。②退火：将温度下降至适宜温度使引物与模板DNA退火结合。③延伸：将温度升至72℃，耐热DNA聚合酶发挥酶活性，以dNTP为底物催化DNA的合成反应。上述3个步骤构成一个循环，新合成的DNA分子继续作为下一轮合成的模板，经多次循环（25～30次）后即可达到扩增DNA的目的。

PCR技术的主要用途：

（1）目的基因的克隆：PCR技术为在重组DNA过程中获得的目的基因片段提供了简便快速的扩增方法。该技术可用于：①与逆转录反应相结合，可以直接从组织和细胞的mRNA获得目的基因片段。②利用特异性引物以DNA或基因组DNA为模板获得已知目的基因片段。③利用简并引物从CDNA文库或基因组文库中提取具有一定序列相似性的基因片段。④利用随机引物从cDNA文库或基因组文库中克隆基因。

（2）基因的体外突变：利用PCR技术可以随意设计引物在体外对目的基因片段进行嵌和、缺失、点突变等改造。

（3）DNA和RNA微量分析：PCR技术高度敏感，对模板DNA的含量要求很低，是DNA和RNA（RNA一般需要先逆转录成为cDNA）微量分析的好方法。从理论上讲，只要存在I分子模板，就可以获得目的片段。在实际工作中，一滴血、一根毛发或一个细胞就足以满足PCR的检测需要。因此、PCR在基因诊断方面具有极广阔的应用价值。

（4）DNA序列测定：将PCR技术引入DNA序列测定，可使测序工作大为简化，也提高了测序的速度。待测DNA片段既可以克隆到特定的载体后进行序列测定，也可直接测定。

（5）基因突变分析：基因突变可引起许多遗传病、免疫性疾病和肿瘤等、故分析基因突变可以为这些疾病的诊断、治疗和研究提供重要的依据。利用PCR与一些技术的结合可以大大提高基因突变检测的敏感性。

PCR技术的发展以及和已有分子生物学技术的结合形成了多种PCR衍生技术，大大提高了PCR反应的特异性和应用的广泛性。与中医学密切相关的PCR衍生技术如逆转录PCR技术、原位PCR技术、实时PCR技术等。尤其是实时荧光定量PCR（Real-time PCR）是由美国Applied Biosystems公司于1996年推出的一项PCR技术。与常规PCR相比，实时荧光定量PCR实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且具有操作方便、快速、高效，特异性更强，结果稳定可靠，自动化程度高等优点。实时荧光定量PCR主要应用于以下几个方面：①定量分析核酸，主要用于病原微生物含量的检测，包括对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类乳头瘤病毒、单纯疱疹病毒、肝炎病毒、结核杆菌、人巨细胞病毒等进行定量测定，还可用于转基因动植物基因拷贝数的检测、RNAi基因失活率的检测等。②分析基因表达差异，实时荧光定量PCR不但能有效地检测到特定基因的表达量，还可用于检测特定基因在不同条件下的表达差异，确证cDNA芯片或差显结果等。③检测碱基的甲基化，常用Taqman探针来区分甲基化和非甲基化DNA。④检测SNP，实时荧光定量PCR能够快速、准确测定SNP，这对于研究个体对不同疾病的易感性或者个体对特定药物的不同反应有着重要意义。

另外，数字聚合酶链式反应（Digital polymerase chain reaction，dPCR）技术属于第三代核酸检测技术，可以在无须建立标准曲线的条件下，实现低浓度的目标核酸分子精确的绝对定量，具有很高的灵敏度及特异性，使其在疾病的发现及治疗等方面表现出了极大的优越性，对于提升国民卫生水平、改善国民生活质量具有很高的发展前景及研究价值。微流控技术的发展促进了新兴核酸检测技术即数字PCR技术的快速发展，使其更加适用于高阶多路复用，在各个领域都有广泛的应用价值，尤其适合于液体活检、肿瘤筛查、产前诊断、致病菌及病毒检测等领域。多重数字PCR在节省检测样本及检测成本的同时，可准确可靠地进行多靶标检测，是满足目前核酸检测需求的理想选择。