冠心病与代谢组学
第十二章 从脾论治心脑血管疾病的现代生物学基础
中医认为，脾主运化，为气血生化之源，“中央土以灌四傍”参与机体营养物质的消化、吸收以及能量代谢，且“脾之为卫”，为后天之本。脾失健运，痰瘀互结，瘀滞日久，脉道不利，最终引发动脉粥样硬化（AS）发生。AS依据临床症状的不同可归属于中医“眩晕”“中风”“胸痹”“脉痹”等范畴，病因与外感六淫、年老体虚、七情内伤、饮食、劳倦等因素相关，病机复杂，现代医家将其概括为虚、瘀、痰、毒四证。《脾胃论》曰：“百病皆由脾胃衰而生也。”孙志广认为，AS的发生与中医“脾”的关系最为密切，具体表述如下：①气虚血瘀。王清任在《医林改错》中指出：“元气既虚，必不能达于血管，血管无气，必停留而瘀。”“脾主运化水谷以长肌肉，五脏六腑皆赖其养。”若脾气旺盛，化生精微物质上输于心，“化赤”生血，输布全身，并约束血行脉中。反之，脾虚气血乏源，气虚推动无力，血虚脉络失养，导致瘀血停滞血脉。②痰浊血瘀。李中梓《医宗必读》记载：“脾土虚弱，清者难升，浊者难降，留中滞膈，瘀而成痰。”脾主运化精微和水湿，若饮食、七情、劳倦等因素损伤脾脏，“脾虚不运清浊，停滞津液而痰生”（《证治汇补》），痰浊日久，壅滞气机，血行不畅，形成瘀血。血水同源，血脉不行，“瘀血既久亦可化痰水”（《血证论》），痰浊、瘀血互为因果结于血脉，使病情缠绵难愈。③毒邪内结。现代医家认为，毒邪瘀阻络脉是AS后期的主要病理机制。尤怡《金匮要略心典》记载：“毒，邪气蕴结之谓也。”且“无邪不有毒，热从毒化，变从毒起，瘀从毒结”。痰郁化热，日久变生毒邪，毒伤血络，血溢脉外亦可化瘀成痰，形成恶性循环。因此，AS的病机究其本质为脾虚为本，化生痰浊、瘀血、毒邪等病理产物相互搏结于血脉为标的本虚标实之证。而AS是许多心脑血管疾病的重要病理基础，基于此，治疗心脑血管疾病从脾论治，既符合中医“治病必求于本”的原则，又可收标本兼治、事半功倍之效。有学者研究从脾论治心脑血管疾病的现代生物学基础可能与机体代谢、炎症反应、细胞凋亡、细胞焦亡、氧化应激、铁死亡等过程有关。
第一节 机体代谢与心脑血管疾病
一、脂质代谢
（一）定义
脂质代谢异常是指脂类物质在体内合成、分解、消化、吸收、转运发生异常，使各组织中脂质过多或过少，从而影响身体机能的情况，这是一种生理病理过程。血液中主要脂质有胆固醇、三酰甘油、磷脂和游离脂肪酸。
（二）脾与脂质代谢
有研究通过饮食失节、过食肥甘厚味等致病因素构建脾虚致大鼠高脂血症的证候模型时发现脾虚高脂血症大鼠模型血液中血清总脂质、载脂蛋白B（ApoB）、脂蛋白（a）含量升高，血清载脂蛋白A（ApoA）含量降低。说明脾虚时机体内的血脂含量升高而抗氧化的能力降低，为脾虚证与高脂血症之间存在相关性做出了初步证实。此研究显示健脾降浊方不同剂量能不同程度降低高脂血症模型大鼠的血清总脂质、ApoB、脂蛋白（a）[Lp（a）]含量、升高血清ApoA的含量，其中大、中剂量健脾降浊方组与血脂康组对比疗效相仿，与绞股蓝组对比疗效优于绞股蓝组。结论：从动物实验角度证明健脾降浊方能有效降低脾虚型高脂血症大鼠的脂质代谢，为从脾论治高脂血症提供可靠的依据。
张镜人提出血脂升高与痰湿、痰热有关：当脾胃的运化功能失健时，饮食水谷等就不能转化为精微物质，致使脂肪代谢失常，聚湿成痰。因为痰性黏腻，若痰与热胶结，或痰与湿潴留，都会导致心络的脂质沉积。而痰湿或痰热会导致心阳与心气的痹阻，相继产生气滞和血瘀，血瘀与气滞又互为因果，逐渐便会形成CHD。沈礼勇的研究结果显示：脂蛋白组分及载脂蛋白的改变是痰浊证的基础病变之一，冠心病痰浊证与脂质代谢紊乱关系密切，故血脂异常可作为痰证辨证的客观化指标之一。孙建芝对痰浊证患者血脂水平和血液流变学的改变进行了研究，结果表明：与非痰浊组和正常人组相比，痰浊证患者血清总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白（LDL）水平均显著升高。陈可冀等对405例胸痹心痛患者的血脂水平进行比较，结果显示：痰浊证与非痰浊证之间血清总胆固醇、甘油三酯、LDL水平有显著差异。
（三）现代生物学基础之脂质代谢
在正常人体内，胆固醇的吸收与合成呈现着动态平衡的关系，胆固醇的供应在细胞功能、组织发育和全身生理等方面产生积极影响。然而，现代医学发现，过量的胆固醇是导致血脂异常的发生的重要原因。近年来，与维持脂质恒常性相关的核内受体、转录因子被阐明，它们可以通过感知细胞内的脂质浓度，或者将脂质作为直接配体进行应答的机制也被逐步揭示。PPARγ作为过氧化物酶体增殖物激活受体，在脂肪组织中拥有着高度的表达，能够参与调节胆固醇代谢以及脂肪细胞相应功能，是调节脂肪细胞分化以及干预储存脂质能力的重要因子，在全身脂质稳态的维持中具有关键意义。miR-27b在脂质水平的作用也被证实，可以控制多个对血脂异常有重要影响的基因。长链非编码RNA（LncRNAs）在脂肪生成；脂肪酸，胆固醇，磷脂代谢和转运；高密度脂蛋白（HDL）和LDL的形成中具有重要调控作用。通常作为微RNA（miRNAs）的前体RNA存在，或充当竞争性内源性RNA（CERNAs）与miRNAs发生相互作用。研究表明，Lnc-NEAT1可负调节miR-27b并作用于PPARγ受体参与脂质代谢。PPARγ调控下游基因，配体依赖性核受体家族中的成员肝脏X受体（LXR）。并通过LXR编码参与甾醇代谢蛋白的基因ATP结合盒转运蛋白G5（ABCG5）和G8（ABCG8）来增加胆固醇的排泄。ABCG5和ABCG8分布于肠细胞和肝细胞的根尖膜上，能够对肠道的吸收功能产生限制作用，并且对胆固醇和植物甾醇的胆汁分泌产生促进作用。LXR受体是ABCG5和ABCG8表达的主要阳性调节因子。ABCG5和ABCG8可以降低循环胆固醇和肝脏胆固醇的含量。在调控胆固醇代谢，防治高脂血症方面具有重要意义。孟嘉伟通过动物实验发现：高脂喂饲能够升高大鼠血脂，使肝细胞泡沫化明显；给予以健脾化痰、活血祛瘀为治法的化瘀祛痰方干预后，大鼠血脂水平明显降低，说明化瘀祛痰方可改善血脂异常；经化瘀祛痰方干预后Lnc-NEAT1基因表达显著升高，miR-27b基因表达显著降低，PPARγ、LXR、ABCG5、ABCG8基因及蛋白表达均显著升高，说明化瘀祛痰方可能通过上调Lnc-NEAT1水平，抑制miR-27b的基因表达，进一步增加PPARγ、LXR、ABCG5、ABCG8基因及蛋白的表达水平，通过促进肝脏胆固醇代谢，从而达到防治高脂血症、预防心脑血管疾病的重要作用。
HDL是颗粒大小极不均匀的一类脂蛋白，成熟HDL呈球状，内层主要由甘油三酯和胆固醇酯组成，外层包绕着如ApoA、卵磷脂胆固醇酰基转移酶（LCAT）、对氧磷酸-1（PON1）等，具有介导胆固醇逆向转运、抗氧化、抗炎、保护内皮等作用。正常情况下，ApoAⅠ与胆固醇和磷脂结合，并通过与细胞膜上的ATP结合盒蛋白A1结合后的一系列反应，最终生成成熟的球形HDL，发挥胆固醇的逆向转运作用；ApoA、PON1、LCAT等可阻止氧化磷脂的生成，还可对已生成的氧化磷脂进行灭活，从而发挥抗氧化作用。研究认为，探讨HDL组分血清淀粉样蛋白A（Serum Amyloid A，SAA）/ApoAⅠ比值具有评估失功能高密度脂蛋白（dyHDL）含量的价值。而在慢性炎症、高脂高糖等状态下，HDL的结构组分会发生改变，如：内层组分胆固醇酯减少，而甘油三酯增多；外层组分ApoA、PON1、LCAT等减少，而由SAA取代。SAA作为dyHDL标志性载脂蛋白，正常情况下体内SAA含量较少，在感染、代谢性疾病、应激反应等情况下含量明显增加。SAA具有与ApoAI相似的结构，体内代谢发生异常，生产的大量精氨基琥珀酸合成酶（ASS）则取代HDL中的ApoAⅠ，抑制了HDL与周围细胞胆固醇结合，降低了ApoAⅠ介导的胆固醇逆向转运，并促氧化以及促炎症反应发生。这不仅使HDL失去抗AS的功能，还表现出抑制胆固醇逆向转运、促炎、促氧化，而导致AS的发生，这种dyHDL其实就是脾虚生痰的病理产物。张会永通过制造脾虚痰浊小猪模型发现，模型组较正常组血清HDL-ApoAⅠ、HDL-PON1、HDL-S1P水平降低，HDL-SAA水平及HDL-SAA/HDL-ApoAⅠ比值增高，提示脾虚痰浊证小型猪的血清HDL发生了结构改变；经健脾祛痰方药治疗后，脾虚痰浊证小猪血清HDL-ApoAⅠ、HDL-PON1、HDL-S1P水平升高，HDL-SAA水平及HDL-SAA/HDL-ApoAⅠ比值降低，提示健脾祛痰方可以通过纠正dyHDL的结构组分，使其恢复正常，起到保护血管内皮及降脂预防心脑血管疾病的作用。
徐跃通过临床试验发现健脾祛痰化瘀法可改善CHD稳定型心绞痛痰瘀互结患者心电图各导联ST段变化，西雅图心绞痛量表积分，改善患者生存质量，改善中医症状，降低总胆固醇、LDL，升高HDL。宋剑南的研究发现健脾化痰的中药能够明显地降低高脂血症动物模型的血清总胆固醇、甘油三酯、LDL水平。王化猛以痰凝为核心，运用化痰法治疗了46例高脂血症患者，发现患者治疗前后的总胆固醇和甘油三酯水平有明显的改变。
综上所述，脂质代谢是从脾论治心脑血管疾病的现代生物学基础之一。
二、巨噬细胞糖代谢
代谢重编程是机体代谢发生异常的统称，涉及代谢相关酶、代谢产物、代谢途径等变化。巨噬细胞是AS斑块中的主要炎症细胞。最新研究发现脂多糖（LPS）诱导巨噬细胞糖代谢重编程引发炎症反应在AS发生发展中发挥关键作用。由于巨噬细胞不能大量储存营养物质，只能从外界环境中大量摄取葡萄糖、氨基酸和脂肪酸才能维持自身的免疫应答。巨噬细胞增强营养物质摄入主要有两个目的：为活化的巨噬细胞提供合成三磷酸腺苷（ATP）的底物从而维持其活动，同时提供巨噬细胞增殖和活化合成大分子（RNA、DNA、蛋白质和细胞膜）的原材料。因此，启动代谢重编程是巨噬细胞应答外界刺激的关键步骤。
（一）巨噬细胞糖代谢重编程——-三羧酸循环（TCA）重置
LPS激活巨噬细胞后，诱导型一氧化氮合酶（iNOS）表达增加，线粒体电子传递链部分靶蛋白的活性下降，从而抑制TCA和氧化磷酸化。尽管LPS激活巨噬细胞后氧化磷酸化受到抑制，但研究发现，TCA中间代谢产物琥珀酸（SA）、苹果酸和延胡索酸等却增加。SA可促进糖酵解影响线粒体ATP生成，并直接抑制脯氨酰羟化酶活化，进而提高缺氧诱导因子1-α（HIF-1α）稳定性。HIF1-α表达增强可增加巨噬细胞白介素-1β（IL-1β）表达促进炎症反应，同时可以激活局部环境中的免疫细胞。杨关林教授团队前期研究发现健脾祛痰化瘀方可降低AS家兔血清和主动脉组织HIF-1α水平。SA主要来源于谷氨酰胺代谢，抑制α-酮戊二酸（α-KG）回补反应或γ-氨基丁酸（GABA）旁路可降低SA水平。
（二）巨噬细胞糖代谢重编程——磷酸戊糖途径（PPP）活化
LPS可活化巨噬细胞PPP，进而高表达PPP的关键酶-葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD），激活p38丝裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）和核转录因子-κB（NF-κB）信号通路，引起胞内氧化应激和促炎性细胞因子的表达；使用化学抑制剂或小干扰RNA抑制G6PD表达可显著减少p38MAPK和NF-κB表达，减少IL-1β、白介素-6（IL-6）等炎症因子表达。美国哈佛大学Paul MRidker教授研究发现IL-1β单克隆抗体用于三期临床试验，可显著减少AS性疾病的发生。LPS诱导巨噬细胞炎症反应在AS发生发展中发挥关键作用，LPS激活巨噬细胞糖代谢重编程，引起TCA重置和PPP途径活化，产生炎症反应，并进一步激活其他免疫炎症细胞，放大斑块局部和机体的炎症反应，促进AS发生发展。
三、线粒体能量代谢
（一）脾与线粒体
1.线粒体结构变化
脾虚证大鼠模型的组织线粒体中超氧化物歧化酶（SOD），谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性比正常大鼠的活性低，而丙二醛（MDA）含量比正常黏膜中显著增高，说明线粒体氧化/抗氧化体系受到严重损伤，提示脾虚证的发生和线粒体的损伤具有密切关系。
2.线粒体膜电位的改变
脾虚证大鼠组织的线粒体膜电位比正常大鼠组织的膜电位显著降低，膜电位的降低提示线粒体内膜的通透性增强，ATP合成降低，细胞能量代谢受损；而“脾为气血生化之源”，脾虚则气血生化乏源，导致气血、营养物质缺乏。因此这种线粒体极性的显著变化，提示我们脾虚证候大鼠模型存在线粒体功能的障碍，故脾虚证与线粒体膜电位变化密切相关。
（二）现代生物学基础之线粒体能量代谢
近年来学术界认为，血管壁细胞线粒体能量代谢异常参与AS发生发展过程中。Dong等发现ApoE-/-小鼠出现线粒体DNA（mtDNA）完整性降低和线粒体呼吸功能下降，但过表达线粒体解旋酶Twinkle（Tw+/ApoE-/-）的ApoE-/-小鼠mtDNA完整性增加、拷贝数及呼吸链功能明显增加，同时AS斑块坏死核心面积明显减少。杨关林教授团队通过对AS家兔进行研究，结果显示高脂导致的AS能使心肌细胞发生形态学改变，心肌线粒体能量代谢相关基因下调，从而导致ATP合成减少心肌能量代谢障碍，而活性氧（ROS）生成增多进一步加重AS；以健脾化痰、活血祛瘀为治法的化瘀祛痰方能上调AS家兔心肌线粒体能量代谢相关基因从而起到改善心肌线粒体能量合成，增加ATP生成，改善心肌能量代谢；减少ROS生成，从而可能起到改善或延缓AS，促进心肌细胞结构的恢复，保护心脏功能和结构的作用。通过对AS巴马小型猪进行研究，健脾化痰祛瘀方可以明显增加AS巴马小型猪线粒体电子传递链上复合物的活性，增加ATP合成，参与线粒体呼吸及能量代谢的调控作用而减轻AS对心肌线粒体的损伤；可通过调节线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ亚基基因表达，改善脾虚痰浊AS巴马猪肝脏线粒体能量代谢功能；可通过对回肠ATP4B、NDUFS2、NDUFS3等与线粒体能量代谢相关基因实现抗AS；可通过提升线粒体呼吸链复合物活性、线粒体能量代谢相关酶的表达对脾虚痰浊AS巴马小型猪肝脏线粒体能量代谢有一定提升作用。因此，线粒体能量代谢异常是参与AS发病的重要机制，是从脾论治心脑血管疾病的现代生物学基础之一，改善血管细胞线粒体能量代谢可能是有效防治AS的新策略。
四、水液代谢
（一）脾与水液代谢
脾主运化水湿。水液代谢及其调控过程需要靠“脾主运化水液”“肾主水”“肝主疏泄”“肺主通调水道”等功能的协调统一，其中脾作为气机升降之枢纽，“脾主运化水湿”的功能在整个水液代谢及其调控过程中起着关键性作用。“痰”作为机体水液代谢失常形成的一种病理产物，若脾不能正常地运化水液，势必会导致痰的产生或加重痰的形成。有研究表明，心脑血管病痰证患者的心钠素、尿素氮、肌酐增高而醛固酮降低。其中尿素氮、肌酐水平的升高说明其肾小球滤过率下降导致了水钠潴留，代谢产物的堆积；而心钠素增高及醛固酮降低，则表明由于水钠潴留，机体调节机制起作用，表现为分泌较多的心钠素并减少醛固酮的分泌，以促进水钠的排泄。
1.电解质
目前，关于腹泻的研究机制认为：致病因素激活腺苷酸环化酶，细胞内ATP转化为环磷酸腺苷（cAMP），细胞cAMP含量迅速升高，Na+-K+-ATP酶活性降低，促使K+从肠黏膜细胞液溢出，Na+和Cl-等进入到细胞内，导致细胞肿胀、坏死，还出现肠腔里水分分泌显著增加而导致腹泻，从而引起机体内电解质的紊乱。有实验结果显示：脾虚模型组的大鼠血清中Na+和K+浓度明显减少，但经过药物干预后，Na+和K+浓度则出现不同程度的升高并且接近正常的水平，而各组Cl-浓度无明显差异。这一现象说明脾虚泄泻大鼠体内的Na+、K+失衡较Cl-更为显著。
2.水通道蛋白
有实验通过检测空肠、结肠黏膜中的水通道蛋白3（AQP3）和水通道蛋白4（AQP4）的表达研究药物调节机体水液代谢的作用。结果表明，脾虚泄泻模型的大鼠空肠黏膜中AQP3含量比空白组含量升高，而结肠黏膜中AQP3含量比空白组的含量降低。说明脾虚模型导致空肠黏膜AQP3的表达升高，从而使肠道中细胞对水的通透性增强，说明空肠在病理情况下发生应激反应时导致AQP3的表达升高，使肠腔的水分升高，可能与脾失健运相关，水谷不化，水反为湿，并走于肠，是导致泄泻的机制。结肠黏膜AQP3的低表达，这与AQP3的低表达可引起结肠黏膜对水的重吸收减少而导致腹泻或便溏的结论相一致。
3.肠蠕动、渗出物排出
脾虚泄泻动物模型胃残留率增加、小肠推进率降低，说明脾虚运化失常后消化、吸收功能严重障碍，多种机制造成胃肠运动减慢。
（二）现代生物学基础之水液代谢
脾虚证存在水液代谢失常的改变，有实验对益气健脾祛痰化瘀法对脾虚痰浊AS巴马小型猪的水液代谢失常的改变及其机制进行研究。结果表明，48周后模型组钾、钠、氯、尿素氮、肌酐水平未见变化，但醛固酮（ALD），猪血管加压素（AVP）、心房利钠钛（ANP）均有上调，ANP、AVP上调有统计学意义，ALD上调未见统计学意义。肾组织AQP1、2、3及Na+-K+-ATP酶蛋白表达下调（P＜0.05），AQP4表达上调。说明脾虚痰浊证候AS模型存在水液代谢的失调，肾脏AQP1、2、3、4功能失调，从脾论治的两种治法益气健脾法及益气健脾祛痰化瘀法能可上调肾组织AQP1、2、3，下调AQP4，益气健脾法可上调Na+-K+-ATP酶（P＜0.05），益气健脾祛痰化瘀法可下调ANP。说明从脾论治可以调节脾虚痰浊瘀血证候AS的水液代谢失常及肾脏水通道蛋白的异常。与模型组比较，益气健脾、祛痰化瘀组ANP、AVP、ALD下均有下调，ANP下调有统计学意义，益气健脾组仅AVP下调，并无统计学意义；益气健脾组及益气健脾、祛痰化瘀组肾组织AQP1、2、3（P＜0.05）；说明从脾论治两种方法均可恢复肾脏水通道蛋白功能；益气健脾组能够上调Na+-K+-ATP酶蛋白表达上调有统计学意义，益气健脾、祛痰化瘀组下调ANP。
第二节 炎症反应
一、脾与炎症反应
脾为生痰之源，脾气虚弱，不能运化水湿，水湿停聚，聚而成痰；不能布精于肺，下输水道，脾在输液输布过程中的枢纽作用无法发挥，清气难升，浊气难降，聚而成痰；摄纳无权，中焦水液泛溢于上，变生为痰。1995年ROSSR提出AS“损伤理论”机制，认为AS形成主要因素是始于内皮细胞损伤而并非脂质堆积，并确切阐述了损伤过程中存在的炎性反应；2002年Peter Libby依据临床流行病学调查结果提出炎症促进动脉粥样斑块的形成。学者们经过几十年的探索和观察，众多研究均已证实炎性反应在AS的起始、发展乃至斑块形成的后期都扮演着重要角色。痰浊包括血液中的脂类等，过度安逸，气血运行不畅，脾胃运化失调，或过食肥甘厚味，损伤脾胃，久则影响气血津液的运行，最终形成痰饮水湿，痰浊日久成瘀，痰瘀即各种病理产物不断堆积，最终形成AS斑块，斑块损伤血管内皮，使血管壁通透性增加，痰浊之邪进入内膜，从而引起一系列炎症反应。
二、炎症反应与AS
AS是许多重要血管不良事件的基础，也是心脑血管疾病发病和死亡的主要原因。炎症反应可促使稳定斑块向不稳定斑块转化，而炎性细胞可进一步加重炎症反应。LDL颗粒是AS炎症反应的始发因素，内皮细胞损伤后引起LDL-C在内膜下累积，促进内皮功能障碍，继而导致血管内皮细胞、平滑肌细胞（VSMC）和巨噬细胞（Mφ）合成ROS，使LDL被氧化为氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL），并通过上调单核细胞趋化因子-1（MCP-1）和细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、P-蛋白和血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）在内的多种细胞黏附分子刺激循环中的单核细胞向斑块浸润。除引发单核-巨噬细胞聚集外，胆固醇结晶也可诱导中性粒细胞释放中性粒细胞胞外陷阱（NET），NET可通过核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3（NLRP3）炎性小体，激活斑块内驻留的Mφ分泌IL-1β等促炎性细胞因子，从而扩大免疫细胞在AS灶的聚集，最后引起斑块内炎症反应。
IL-6、肿瘤坏死因子（TNF-α）、ICAM-1都是强效的促炎性细胞因子，它们都可通过不同途径激活JAK2/STAT3信号路径，参与免疫炎症反应；白介素-10（IL-10）是一类具有抗炎作用的细胞因子，在限制宿主对病原体的免疫应答等方面起重要作用。王佳楠通过建立脾虚痰浊巴马猪模型结果显示，24周时模型组具有促炎性作用的细胞因子包括TNF-α、IL-6、ICAM-1明显上升，而抗炎性细胞因子IL-10的含量显著下降，表明脾虚痰浊巴马猪体内存在着明显的炎症反应，炎症浸润及内皮损伤共同促进了AS的发生与发展。
三、炎症相关信号通路与AS
（一）丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶是存在于细胞表面的一种信号物质，多种刺激（如神经递质、细胞因子、内毒素及血液剪切力等）能够激活MAPK，其中细胞外信号调节激酶（ERK）1/2通常被有丝分裂原激活，而p38和Jun氨基末端激酶（JNK）大多被细胞应激或细胞因子生成的信号激活，最终将活化的激酶易位至细胞核，多种靶标磷酸化，引发细胞产生相应变化。MAPK信号通路级联的3个主要臂是ERK1-7、JNK1-3和p38。其中，p38家族的4个成员（p38-α、p38-β、p38-γ和p38-δ）在AS的泡沫细胞形成中发挥重要作用，p38-α和p38-β亚型被蛋白激酶MKK3和MKK6激活，发挥应对炎性细胞因子、生长因子和应激环境等刺激的作用。通过刺激ERK1/2、p38-α和p38-β可上调关键的炎性转录因子，如NF-κB、信号传导与转录激活因子（STAT）-1和STAT-3，同时，激活p38-α会使TNF-α、IL-1等炎性因子的表达量增加，这些分子在促AS发展的各阶段均发挥十分重要的作用。
（二）NF-κB
NF-κB存在于大多数细胞类型的细胞质中，参与调节细胞活性，如炎症和免疫应答，细胞生长、分化和增殖，是一种普遍存在于真核细胞中的多效性转录调节因子。NF-κB参与AS病理过程的可能机制：①调节泡沫细胞形成：泡沫细胞形成是AS早期病理发展过程的关键事件，越来越多的证据表明，NF-κB具有促进泡沫细胞形成的效应，从而增加AS斑块面积。②介导炎性反应及相关分子表达：NF-κB信号可调控多种炎症反应和免疫应答的相关基因表达，如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8和黏附分子等，从而影响局部或全身性炎症反应，其中，TNF-α和IL-1β既是NF-κB信号通路激活后的下游产物，也可以诱导激活NF-κB通路；NF-κB激活黏附分子（如细胞间黏附分子-1、血管细胞黏附分子-1和选择素蛋白等）的过度表达，增加炎症期间单核细胞的附着能力，提高单核细胞从血管募集至局部病变血管壁的概率；研究显示，替代激活NF-κB元件基因p100缺失的小鼠，其胸腺发育正常，但可抑制调节性T细胞的表达，抑制NF-κB的激活，还可以减少巨噬细胞极化为M1型促炎巨噬细胞的数量，防止AS发展全程中的过度炎症反应进一步加重。③促进血管平滑肌细胞增殖和转移：在冠状动脉平滑肌细胞中，TNF-α激活的NF-κB迁移至细胞核并发挥转录活性，介导平滑肌细胞大量增殖并转移至局部病灶。④NF-κB会损伤内皮细胞、加重动脉血管钙化、促进血小板形成和破裂等。
（三）Toll样受体4（TLR4）
TLR4对于炎症和脂质积聚的激活起着重要作用，与AS斑块的进展和脆弱性关系密切，其参与AS形成过程的可能机制有：①介导炎症反应：TLR4可以激活NF-κB产生促炎细胞因子；诱导白细胞募集于主动脉平滑肌细胞中，并增加促炎性细胞因子的表达量，如单核细胞趋化因子、IL-1α和IL-6的释放；ox-LDL通过尿激酶受体与CD36及TLR4反应，可增强血管平滑肌细胞的炎症反应。②调节三磷酸结合盒转运体G1（ABCG1）分子：ABCG1是抑制炎症和细胞脂质蓄积于血管平滑肌细胞的关键基因，TLR4通过PPARγ下调ABCG1表达。③促进泡沫细胞形成：TLR通过与内外源性配体结合而激活，在高血脂微环境中，ox-LDL诱导的TLR4及酪氨酸激酶依赖的胞饮作用增强，导致病灶处的单核-巨噬细胞内大量脂质堆积，从而导致AS中泡沫细胞含量增加，进一步加剧AS的病理过程。④影响血管功能及重构和动脉粥样斑块的稳定性，从而影响疾病的发生和发展。
（四）Janus激酶/STAT（JAK/STAT）
JAK信号转导子和STAT转录激活子是多种细胞因子和生长因子在细胞内传递信号的共同途径，JAK激酶（JAK1、JAK2、JAK3）和酪氨酸激酶可激活细胞因子的通路，从而参与机体免疫反应、血管细胞迁移增殖和凋亡等多种生物学活动，同时也是调节AS启动和进展的重要信号通路。JAK/STAT信号通路通过增强和延长可使巨噬细胞向促炎症表型分化，并分泌大量的促炎细胞因子，如IL-6和血管细胞黏附分子-1等。在AS模型小鼠中，当p-STAT3水平升高时，血浆和主动脉组织中的IL-6和TNF-α水平明显升高，STAT1和STAT3的持续磷酸化会加重AS病变发展。此外，IL-12则可激活STAT4，继而促使T细胞分化为T辅助（Th）1表型，后者分泌大量的干扰素和TNF-α，介导巨噬细胞的活化，并促进AS的发展和斑块的扩大。但是，IL-4可以激活STAT6促进Th2细胞的分化，而Th2细胞具有抗AS活性。
（五）Notch信号通路
研究显示，巨噬细胞的Notch活化情况在一定程度上可影响AS的进展。配体DLL-4结合Notch信号受体，不仅可以促分化为M1促炎表型巨噬细胞，还可抑制M2抗炎表型巨噬细胞的分化。Notch信号与巨噬细胞是相互促进的，巨噬细胞释放炎症介质并激活Notch信号通路，使Notch受体、配体表达增多；反过来，Notch通路的激活促进巨噬细胞合成分泌更多的炎性因子，如基质金属蛋白酶等加重炎症反应。Notch信号与巨噬细胞的相互作用被认为是由Toll样受体介导的，Toll样受体是固有免疫与适应性免疫之间的桥梁，而NF-κB通路则是Toll样受体与Notch的交集通路，脂多糖等Toll样受体激动剂引起的巨噬细胞Notch1表达上调，是通过激活NF-κB信号通路实现的。内源性配体如ox-LDL，与Toll样受体结合会激活细胞间NF-κB信号通路，产生一系列促炎分子和促AS因子。
（六）磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）
Akt也称PKB，是PI3K最关键的效应因子，由3种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（Akt1-3）组成，PI3K被激活后将信号传至下游分子Akt和哺乳动物雷帕霉素靶标（mTOR），参与细胞多重生物学过程。PI3K/Akt信号通路参与巨噬细胞极化过程，促进巨噬细胞分化为M1型，加速AS发展进程。
四、现代生物学基础之炎症反应
研究表明，以健脾化痰、活血祛瘀为治法的祛痰化瘀方可降低CHD炎症因子（TNF-α，IL-6）水平，抑制冠脉核转录因子NF-KB p65核移位，降低超敏C-反应蛋白（hs-CRP）水平，同时升高抗炎单核细胞比例，升高主动脉血管抗炎细胞因子水平，抑制炎性因子水平，从而抑制动脉局部的免疫反应，并可以促进单核细胞、成熟巨噬细胞向M2型巨噬细胞分化，从而抑制AS的发生发展。具有祛痰化瘀功效的血脉宁能够显著改善稳定型心绞痛痰瘀互结证患者临床症状、减少硝酸甘油用量，提高心绞痛疗效的总有效率等，可显著改变外周血中IL-23/IL-17轴及炎性因子（IL-23、IL-17A、TNF-α、IL-1β、IL-6）的含量发挥抗炎作用，亦可显著降低MI/RI大鼠血清肌钙蛋白T、乳酸脱氢酶含量，减少炎性细胞浸润，通过调控IL-23/IL-17轴的活化、抑制TNF-α、IL-1β、IL-6等炎性因子的表达而发挥抗炎作用，进而发挥心肌保护作用。
第三节 细胞凋亡
一、定义
细胞凋亡是指多细胞生物体内的某些细胞按一定程序自我毁灭的过程。它是一个主动过程，由基因控制的细胞自主的有序的死亡，涉及一系列基因的激活、表达及调控等。凋亡过程分为外源性和内源性途径。外源性凋亡途径因细胞外微环境的改变而触发，当细胞外死亡配体激活质膜上的死亡受体，外源性凋亡便启动。其过程依赖死亡诱导信号复合物（DISC）的形成，DISC中激活的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶（Caspase）-8和10通过Caspase-3的裂解触发Caspase级联反应，最终通过切割多种细胞靶标导致细胞死亡。内源性和外源性途径均导致Caspase-3激活。内源性途径的关键步骤是线粒体外膜通透化（MOMP），这个过程能够从线粒体膜间空间释放促凋亡因子，如细胞色素C。细胞色素C被释放到胞质溶胶中，与凋亡肽酶激活因子-1（Apoptotic protease activating factor-1，Apaf-1）及ATP结合，推动形成一种称为“凋亡体”的蛋白质复合物，该复合物诱导Caspase-9的活化。Caspase-9的活化激活Caspase-3及Caspase-7，最终导致细胞因被Caspase切割而亡。
二、冠心病相关细胞凋亡
CHD发生发展与血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、巨噬细胞以及心肌细胞等的凋亡失衡密切相关，且冠状动脉病变的严重程度与细胞凋亡呈正相关。其中，内皮损伤和细胞凋亡是始动因素；血管平滑肌细胞过度增殖和迁移、巨噬细胞凋亡是发展因素；心肌细胞凋亡则是心肌缺血缺氧损伤的表现。
（一）血管内皮细胞凋亡增加
血管内皮细胞是构成冠状动脉内壁的主要细胞，具有吞噬和分泌功能，参与冠状动脉和心脏多种生理和病理过程。临床上，多种原因诱导的血管内皮细胞损伤是触发冠状AS形成的首动因素；同时，内皮细胞过度凋亡能诱导斑块侵蚀，内膜下胶原直接与血流接触，从而增加非斑块破裂性血栓事件的风险。研究显示，CHD血瘀证患者存在凋亡相关转录因子Bcl-2的差异表达。而对于早发CHD患者，其血管内皮细胞凋亡数目明显增加，可能与HDL含量降低有关；进一步实验证实，低水平HDL能升高ROS含量，激活Caspase-3、Caspase-9活性，进而促进人脐静脉内皮细胞凋亡。而在ox-LDL诱导的血管内皮损伤中，下调的张力蛋白同源基因和激活的信号转导和STAT3信号通路介导了细胞增殖抑制和凋亡促进过程。此外，lncRNA牛磺酸上调基因1（TUG1）在CHD患者中表达上调，当敲低lncRNA TUG1表达时，内皮细胞凋亡数目减少，且IL-8含量降低，表明lncRNA TUG1通过调节细胞凋亡和炎性因子，参与CHD发生发展。
（二）血管平滑肌细胞和巨噬细胞凋亡失衡
血管平滑肌细胞构成冠状动脉血管壁的肌层部分，在冠状AS的病理状态下，平滑肌细胞增生，合成并分泌胶原纤维蛋白，促进管腔狭窄和管壁硬化。巨噬细胞为具有吞噬作用的免疫调节细胞，吞噬LDL后形成泡沫细胞，促进脂质斑块的形成。研究发现，死亡受体5（DR5）及其配体TRAIL主要表达于平滑肌细胞和巨噬细胞中，其浓度越高，冠状动脉病变的程度越重。而在冠状AS组织中，Bax、死亡相关蛋白激酶（DAPK）和瞬时受体电位通道5（TRPC5）等凋亡相关基因表达异常是造成细胞凋亡失衡的重要原因。其中，TRPC5出现异常高表达，当降低TRPC5水平时，ox-LDL诱导的巨噬细胞增殖抑制和凋亡促进作用被抑制，其潜在的调节机制为减少Caspase-3表达和Akt信号通路。由此可见，死亡受体介导的凋亡是血管平滑肌细胞和巨噬细胞异常凋亡的主要途径。
（三）心肌细胞凋亡增加
心肌细胞是心脏发挥正常舒缩功能和电活动的载体，其细胞凋亡参与心肌缺血缺氧损伤的病理过程。研究发现，在CHD猝死早期或轻度缺血状态下，细胞凋亡可能为心肌细胞死亡的主要方式，其受Bax和Bcl-2蛋白表达的影响。当Bax/Bcl-2表达失衡时，线粒体途径被激活，促进了心肌细胞凋亡。另有研究报道，心肌缺氧能通过促进Rho相关蛋白激酶1（ROCK1）和Rho相关蛋白激酶2（ROCK2）基因表达，进而激活Caspase-3和p-PI3K介导的凋亡途径。当ROCK1和ROCK2表达沉默时，由缺氧诱导的大鼠心肌细胞增殖减弱及凋亡增强得到一定改善。同时，在CHD猝死心肌组织中，程序性细胞死亡因子4（PDCD4）表达上调能促使细胞过度凋亡，细胞间连接过度破坏和端粒酶表达增强。因此，心肌缺血缺氧能诱导多种凋亡相关因子和炎性因子表达，从而促进心肌细胞出现异常凋亡。
三、现代生物学基础之细胞凋亡
目前，死亡受体信号途径、线粒体途径以及内质网应激（ERS）是细胞凋亡的三大途径。其中，ERS途径是一种新的途径。内质网是细胞内调控蛋白合成、折叠和钙稳态的重要细胞器，对环境变化十分敏感。钙稳态失衡、胆固醇超负荷等理化改变均可导致内质网功能紊乱，导致未折叠或错误折叠的蛋白质在内质网腔内蓄积，进而引起内质网应激。PERK、ATF6和IRE1是未折叠蛋白信号系统主要的三条信号途径。早期ERS通过激活未折叠蛋白反应使细胞内蛋白质合成暂停、恢复内质网稳态，起到保护细胞作用。在ERS的诱导因素持续存在的情况下，ERS持续进行，并会触发C/EBP同源蛋白（CHOP/GADD153）等通路诱导细胞凋亡。研究发现巨噬细胞的凋亡在AS的进展期尤其是晚期，对维持斑块的稳定性中起重要的作用。王英研究发现经化瘀祛痰方预处理24小时的RAW 264.7巨噬细胞发生凋亡的细胞数明显减少，且呈剂量依赖性。表明化瘀祛痰方对ox-LDL诱导的巨噬细胞损伤具有保护作用。ATF6是ERS途径重要的分子之一。正常情况下主要存在于胞质中。当ERS状态时，ATF6激活，转位到细胞核中，部分作为转录因子与内质网应激反应元件结合（ESRE）编码产生更多的内质网分子伴侣，从而提高内质网内相应信号蛋白的折叠能力。此外，ox-LDL作用巨噬细胞24小时后，ATF6由胞浆转入细胞核内，而化瘀祛痰方含药血清各组，发生核转位的程度减轻，呈现剂量依赖方式。表明化瘀祛痰方可能是通过抑制ATF6的激活而发挥其保护巨噬细胞的作用。CHOP是内质网应激特有的一个转录因子，正常情况下含量很低，主要存在胞质中；细胞应激状态下，表达量会增加。本研究的结果也发现ox-LDL诱导CHOP蛋白表达升高，化瘀祛痰方含药血清可以明显抑制CHOP蛋白表达，表明化瘀祛痰方可能是通过抑制CHOP蛋白表达而抑制巨噬细胞凋亡。Bcl-2是一种抗凋亡蛋白。本研究的结果也发现ox-LDL损伤RAW 264.7巨噬细胞Bcl-2蛋白的表达下降，而化瘀祛痰方增加Bcl-2蛋白的表达，呈剂量依赖方式。表明化瘀祛痰方含药血清可以通过上调Bcl-2蛋白表达而发挥抑制RAW 264.7巨噬细胞凋亡的作用。结论：化瘀祛痰方含药血清可抑制ox-LDL所诱导的RAW264.7巨噬细胞凋亡，其机制可能与抑制内质网应激相关蛋白ATF6的激活以及CHOP蛋白表达，促进Bcl-2蛋白表达有关。程岩岩通过建立AS巴马小型猪模型，发现模型组巴马小型猪心肌Bax表达明显升高，而Bcl-2表达明显降低，Cyto C、Caspase3在心肌表达明显增加，说明脾虚痰浊AS可以降低Bcl-2/Bax的比值从而诱导细胞色素C从线粒体中的释放，激活Caspase3，诱导心肌细胞的凋亡。而健脾化痰祛瘀方治疗的脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌细胞Bax表达明显减低，而Bcl-2表达明显升高，Cyto C表达显著减低，Caspase3在心肌表达明显减少，说明健脾化痰祛瘀法可以提高Bcl-2/Bax的比值从而抑制细胞色素C从线粒体中的释放，抑制Caspase3的生成，抑制心肌细胞的凋亡。结论：健脾化痰祛瘀法可以减少脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌细胞Bax、Cyto C，Caspase3表达，增加Bcl-2的表达，进而改善心肌细胞凋亡水平。刘玲通过制造心肌缺血再灌注损伤大鼠模型，探讨调脾护心方对心肌缺血再灌注损伤的保护作用及机制，得出：调脾护心方可明显降低大鼠血清磷酸肌酸激酶同工酶、肌钙蛋白Ⅰ、乳酸脱氢酶含量，延缓心肌发生缺血再灌注损伤；可改善心肌病理学变化，保护心肌细胞；可上调PI3K、Akt蛋白的表达，抑制细胞凋亡；可降低Bax mRNA的含量，升高Bcl-2 mRNA的含量，抑制心肌细胞凋亡；调脾护心方预处理对MIRI具有保护作用，具体机制可能与其激活PI3K/Akt信号通路参与调控凋亡基因抑制细胞凋亡有关。唐冰镕采用线栓法制备神经功能缺损模型探讨从脾论治脑病的机制。结果：健脾益气方可以改善大鼠神经功能缺损情况，促进神经功能的恢复，减少神经细胞损伤；健脾益气方上调细胞外基质Fibulin-5的表达，减少Caspase-3蛋白表达，增加P-Akt、P-BAD、Bcl-2蛋白表达，降低凋亡指数AI。结论：健脾益气方可能通过稳定神经元细胞外基质，从而抑制细胞发生凋亡，起到保护脑缺血损伤的作用。
第四节 细胞焦亡
一、定义
细胞焦亡是一种介于坏死和凋亡之间的程序性细胞死亡模式，由炎性小体复合物感知病原信号后，激活Caspase而引起，其通过促使炎性因子释放而参与AS形成与进展，并与斑块的稳定性密切相关。其特征是细胞膜上形成微孔和囊泡，细胞肿胀、破裂，分泌促炎症反应细胞因子，释放细胞质成分至细胞外，对邻近细胞产生促炎信号，快速启动机体天然免疫而引起炎症反应，最终使细胞发生渗透性崩解。其发生机制为内源性和外源性刺激信号通过不同途径作用于炎性小体而激活Caspase-1，介导细胞渗透性肿胀破裂，形成细胞膜小孔，泡内物质流出，IL-1β、IL-18前体裂解并诱导其他炎性因子、黏附分子等合成和释放，放大局部和全身炎症反应。
二、脾与细胞焦亡
肠道中的微生物直接参与饮食物的消化吸收，是脾主运化功能的微观表现；维持肠道菌群平衡是脾主运化的主要生理功能，而肠道菌群失调是脾虚的重要病理因素。脾失健运，肠道菌群失调，代谢生成氧化三甲胺（TMAO）增多，促使肝脏生成SAA，进而激活NLRP3炎症小体，介导巨噬细胞焦亡发生，促进AS免疫炎症反应，导致“脉道不利”。其中，肠道菌群失调，代谢生成TMAO增多是“脾病，脉道不利”的关键环节之一；SAA是激活NLRP3炎症小体的关键分子；NLRP3炎症小体激活，介导巨噬细胞焦亡是关键途径。益气健脾、祛痰化瘀法可能通过调节肠道菌群，进而调控TMAO/SAA/NLRP3炎症小体通路，抑制巨噬细胞焦亡的发生，减少炎症因子IL-1β、IL-18的释放，从而发挥抗炎、调节免疫以抗AS发生发展的作用。
三、现代生物学基础之细胞焦亡
20世纪末，人们一直将细胞凋亡等同于细胞程序性死亡。随着研究的不断深入，逐渐发现细胞程序性死亡包括凋亡、胀亡、自噬以及焦亡。细胞焦亡的诱导、发展和调控与人类健康及疾病发生存在密切关系，已经成为近年来的研究热点之一，可能是多种疾病及病理变化的潜在分子机制。细胞焦亡为近年来研究发现的一种新型细胞程序死亡方式，其发生伴随着炎症反应的发生。NNLRP3是目前研究最为深入的一种炎性小体，它通过识别PAMPs和DAMPs，与ASC相结合，并招募pro-Caspase-1，形成NLRP3炎性小体，进而使Caspase-1活化。NLRP3炎性小体是具有最广泛激活剂的炎性小体。AIM2是第一个被鉴定的非NLR家族蛋白，但它是形成炎性小体的重要成员。AIM2由配体经多个结合位点聚集而形成，具有两个特征性结构域：一个N端PYD结构域和一个C端HIN200结构域。AIM2炎性小体由AIM2、ASC和Caspase-1组成，AIM2通过PYD-PYD相互作用而与ASC结合，然后募集pro-Caspase-1，促进Caspase-1的激活以及IL-1β和IL-18的成熟。另外，GSMDM在2015年被发现，是炎性Caspase的一个底物。GSDMD属于一个功能未知的Gasdermin蛋白家族，Gasdermin蛋白家族的N端大都可以引发细胞焦亡，并最终通过启动细胞焦亡而激活天然免疫反应。通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在小鼠巨噬细胞中针对Caspase-1和Caspase-11介导的细胞焦亡通路，分别进行了全基因组范围的遗传筛选，发现所有炎性Caspase的一个共同底物蛋白是GSDMD，该蛋白质的切割对于炎性Caspase激活引发细胞焦亡具有重要作用；这一研究证明了Gasdermin蛋白家族具有诱导细胞焦亡的功能，并且是细胞焦亡的直接和最终执行者。有实验以细胞焦亡为切入点，对化瘀祛痰方防治心脑血管疾病的分子机制进行研究。结果显示，AS家兔心肌发生了缺血的变化，在此过程中有细胞焦亡参与，模型家兔心肌组织及血清IL-18和IL-1β较正常组均升高，经化瘀祛痰方干预后下降；并且模型家兔细胞焦亡相关蛋白AIM2、CASP1、GSDMD及NALP3表达较正常组上升，提示细胞焦亡可以分别通过炎性小体AIM2及NALP3分别介导CASP1蛋白的激活，并且激活GSDMD蛋白诱导细胞焦亡。经过化瘀祛痰方干预后发现CASP1、GSDMD及NALP3蛋白表达均下降，提示化瘀祛痰方能有效抑制细胞焦亡水平。结论：化瘀祛痰方可以通过影响细胞焦亡改善AS家兔心肌的变化。
研究发现，GSDMD蛋白是细胞焦亡中形成细胞孔道的特征性效应分子，其N末端片段的孔隙形成是发生细胞焦亡的驱动因素。Shi等发现，GSDMD－/－鼠细胞焦亡的数量明显减少，可见GSDMD蛋白在细胞焦亡中的重要作用。炎症小体调控细胞焦亡的发生，活化的NLRP3炎症小体是一种基于NLRP3受体寡聚而形成的大分子复合物。NLRP3蛋白通过NACHT结构域发生自我寡聚，借助PYD结构域与接头蛋白ASC发生相互作用，进而通过CARD结构域招募胞内Caspase-1前体，并使之发生自我剪切，释放出具有水解酶活性的成熟Caspase-1。活化的Caspase-1将剪切底物IL-1β及IL-18前体转变成具有促炎功能的成熟IL-1β及IL-18，并释放至胞外。研究发现ox-LDL促进巨噬细胞Caspase-1活化，并且NLRP3/Caspase-1通路参与ox-LDL诱导的人巨噬细胞裂解、DNA断裂以IL-1β和IL-18的产生，缺乏IL-1β可降低ApoE－/－小鼠AS的严重程度。于宁等观察人参皂苷Rb1对高脂血症大鼠肝脏细胞焦亡的影响时发现，模型组大鼠肝脏的GSDMD蛋白及其mRNA显著升高；经过人参皂苷Rb1治疗后，大鼠肝脏的GSDMD蛋白及其mRNA表达显著降低，说明人参皂苷Rb1具有抑制高脂血症大鼠肝脏细胞焦亡的作用。模型组大鼠肝脏NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显著升高，提示细胞焦亡参与了高脂血症大鼠肝细胞的损伤过程，而肝细胞焦亡相关因子NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18可能是引起炎症反应的重要因素。经过人参皂苷Rb1治疗后，大鼠肝脏的NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18蛋白及mRNA表达显著降低，说明人参皂苷Rb1具有一定程度的抑制高脂血症大鼠肝脏细胞焦亡的作用。结论：人参皂苷Rb1通过降低肝细胞焦亡相关因子的表达实现对高脂血症大鼠肝脏的保护作用。
第五节 线粒体功能
一、定义
线粒体是真核细胞的细胞动力。其主要功能是通过氧化磷酸化的过程产生ATP。ATP是一种以化学键形式储存能量的核苷酸。能量来自细胞营养物质，主要来自葡萄糖和脂肪酸，这些需要能量的细胞功能包括膜转运、合成化合物以驱动代谢反应和机械功。它们是柔性的和杆状的，直径在0.5～1.0μm。线粒体的膜系统由光滑的线粒体外膜和折叠的线粒体内膜组成，被一个称为膜间空间的狭窄空间隔开。矩阵空间，或是晶间空间，线粒体是由内膜包围的大空间，这些成分在细胞功能中发挥着重要作用，并对线粒体的主要功能做出贡献。
线粒体为动物细胞提供能量，外膜上有大量的孔蛋白，是跨膜蛋白通道它允许大分子和小分子自由扩散。它可以允许大到10kDa的分子和小到6kDa的分子。这种膜对离子和小分子具有相对的渗透性，因此膜间空间的内容物类似于细胞质。然而，线粒体的主要功能被发现在线粒体内膜和基质空间线粒体内膜折叠成嵴，为ATP的合成提供了更大的表面积。该膜含有大量的心磷脂，这使后者几乎不渗透质子、电子和离子的磷脂。ATP合成酶和呼吸链，这两种蛋白质复合物，ATP合成酶负责ATP的生成，而呼吸链保持质子梯度，为氧化磷酸化提供能量。基质空间充满了一种稠密的液体，主要由负责将脂肪酸和丙酮酸降解为代谢中间乙酰辅酶a的酶组成，丙酮酸是葡萄糖代谢的初始产物，在细胞质中被运输到线粒体中。基质空间也包含线粒体遗传系统，线粒体双链环状脱氧核糖核酸（cDNA）和线粒体基因组表达所需的酶，虽然有自己的遗传系统，但线粒体正常形成和功能所需的基因编码蛋白质位于细胞核的基因组中。
二、脾与线粒体功能
线粒体能量代谢是脾主升清功能正常的重要体现。脾主运化，以升清为主，为后天之本，将饮食化为水谷精微，向上输于心、肺、头目等，通过心肺的作用化生气血，滋养、濡润机体各脏腑组织器官，是维持线粒体功能的必要物质来源，同时与线粒体转化氨基酸、脂肪、糖通过三羧酸循环进行物质代谢和能量代谢功能相似。线粒体为半自主性细胞器，其DNA的调节受很多后天因素的影响，这与脾为后天之本相吻合。
三、现代生物学基础之线粒体功能
线粒体ROS、能量代谢与AS研究表明，促进AS疾病的条件因素如高血糖、吸烟，会增加线粒体活性氧（mitoROS）生成从而促进mtDNA氧化损伤。由于mtDNA靠近线粒体ROS的来源，又缺乏保护性的组蛋白，它容易积累氧化损伤。随着mtDNA损伤的增加，足够的mtDNA损伤可导致线粒体和细胞功能障碍。已证实mitoROS的生成增加、mtDNA损伤积累与线粒体（呼吸链）进行性功能障碍之间的关联性，及其在AS动物模型中的作用。增多的mitoROS使线粒体膜通透性转换孔开放，破坏线粒体膜电位，解偶联呼吸链，引发线粒体能量生成障碍。mtDNA损伤和线粒体能量代谢障碍，被认为在衰老和维持斑块完整性所必需的VSMCs能量下降中发挥着重要作用。VSMCs是血管壁和斑块的主要合成和结构成分。为了应对AS形成过程中的损伤，VSMCs将从收缩型向合成表型转化，并在斑块中缓慢增殖、完成更多的细胞分裂，这也引发了mtDNA损伤反应。VSMCs的增殖和修复需要线粒体提供更多的ATP，同时线粒体产生过量ROS和氧自由基，从而进一步导致mtDNA损伤、基因组不稳定和线粒体能量生成障碍。这些都会加速AS斑块的形成，并限制VSMCs的再生。杨关林教授团队之前的研究也证实在AS的模型中，mitoROS生成增多，线粒体能量代谢异常。
线粒体氧化应激、炎症反应与AS线粒体不仅产生ATP和ROS，而且在免疫反应中起着关键作用。线粒体被认为是促AS炎症信号的调节因子。在AS形成过程中，脂肪酸和甾醇晶体等代谢应激因子可聚集在线粒体上，并与mtDNA损伤结合刺激炎症反应。而氧化应激和细胞氧化还原失衡也会导致内皮功能障碍。由于一氧化氮的减少导致一氧化氮介导的细胞信号通路的缺失，从而在内皮依赖性血管扩张剂和内皮源性血管收缩剂（如血管紧张素Ⅱ）之间造成失衡。在这种情况下，内源性一氧化氮合酶有利于产生ROS，从而激活内皮细胞。内皮细胞的活化存在可逆性，活化的内皮细胞在炎症刺激停止后可能会回到静止状态。而未受抑制的内皮细胞活化可能导致内皮细胞凋亡。斑块巨噬细胞表现出介于M1和M2两个极端之间的表型范围，可发生功能表型的转换。经典的M1巨噬细胞是由炎症细胞因子包括TNF-α诱导的。M1巨噬细胞特点是表达广谱促炎细胞因子和趋化因子，这些巨噬细胞还释放高水平的ROS和一氧化氮（NO），进而诱导循环中的单核细胞和免疫炎症细胞在动脉病变部位聚集，从而促进炎症的发展，加速AS斑块形成。M2巨噬细胞由Th2细胞因子诱导，分泌大量抗炎IL-10，通过抑制炎症反应，产生抗AS作用。在AS斑块病变中，M2巨噬细胞明显减少，而M1巨噬细胞明显增加。
线粒体自噬、细胞凋亡与AS线粒体自噬对维持线粒体健康非常重要。通过线粒体自噬途径可及时清除受损线粒体，维持ROS在一个较低水平。线粒体自噬是一种特殊形式的自噬，溶酶体在自噬过程中隔离并降解功能失调的线粒体，并回收其成分以再次利用。通常线粒体自噬能降解受损的线粒体，但mtDNA可逃避降解并激发炎症反应；mtDNA也可被释放到循环中，导致全身炎症反应。线粒体自噬过程紊乱，功能失调的线粒体增多，产生大量ROS。ROS是自噬的上游调节器，ROS生成增多使mPTP开放，线粒体膜通透性下降，释放细胞色素C，激活胞浆内的Caspase-9，触发包括细胞凋亡在内的细胞死亡。因线粒体调控细胞凋亡/死亡，故破坏其结构或功能可促进细胞凋亡。内皮细胞凋亡，导致不可逆的内皮损伤、内皮细胞破碎并与内膜分离或内皮细胞功能障碍，造成AS发生及血管内皮细胞通透性增加，容易引发脂质沉积，促使AS的发生和发展。而线粒体呼吸链功能障碍与血小板来源的VSMCs样本中线粒体自噬增多有关。平滑肌细胞的过度死亡导致胶原合成减少，纤维帽变薄，斑块不稳定，病变血栓形成和急性临床事件。巨噬细胞凋亡和氧化应激增加会导致斑块面积增加和坏死，加速AS进展。氧化应激加上有缺陷的自噬可能在调节AS斑块发展中发挥根本作用。
有研究发现cAMP/PKA-Gp通路是细胞能量代谢的主要通路，并从正常大鼠、脾气虚大鼠、鱼藤酮损伤大鼠的下丘脑组织中发现脾虚大鼠和鱼藤酮损伤大鼠的cAMP的活性降低，蛋白激酶A（PKA）、糖原磷酸化酶（Gp）、磷酸化酶激酶（PHK）、mRNA以及蛋白表达均降低。在给予健脾药物之后，脾气虚大鼠和鱼藤酮损伤大鼠的cAMP活性增加，PAK、Gp、PHK、mRNA以及蛋白质的表达均较之前增多。鱼藤酮是抑制线粒体发生氧化还原反应的物质之一，因此，脾气虚大鼠与线粒体功能障碍可能都与cAMP/PKA-Gp通路有关，影响能量的代谢，进而发展成为AS。
第六节 氧化应激
一、定义
氧化应激是活性氧过量生成，细胞内抗氧化防御系统受损，导致氧自由基及相关代谢产物过量聚集，从而对细胞产生多种毒性作用的病理状态。氧化应激学说是AS发病学说的重要组成部分，认为在病理状态下出现氧化应激，活跃的氧自由基进一步损伤脂质、蛋白质、核酸等生物大分子，其中脂质过氧化是氧化应激致AS血管损伤的关键病理环节。
二、现代生物学基础之氧化应激
氧化应激可以由ROS引发，当活性氧的产生过多和抗氧化系统之间出现了不平衡的现象时氧化应激产生，导致细胞的损伤凋亡等。杨关林团队通过实验证明脾虚痰浊AS巴马小型猪模型可以对心肌线粒体造成氧化损伤，诱导凋亡。在AS过程当中，如果CAT、GSH-Px含量下降，会导致对自由基的清除能力下降，导致大量氧自由基积蓄，细胞生物膜的功能被破坏，细胞受损伤，氧化应激作用增强，MDA等毒性物质增多。结果表明，健脾化痰祛瘀方可以提高CAT、GSH-Px含量从而减少脂质过氧化物反应的最终产物MDA，从而减少氧化应激的损伤。健脾化痰祛瘀方可以减少脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌线粒体ROS、MDA的生成，增加其抗氧化酶CAT、GSH-Px的表达，从而减少心肌线粒体的氧化应激水平。
现在认为血管内皮细胞的损伤和功能改变是AS发生、发展的始动环节，在动脉斑块进展过程中起着重要作用。ox-LDL是LDL被氧化后的产物，其主要通过细胞毒性作用及参与氧化应激作用直接损伤内皮细胞，其还可以通过促进泡沫细胞形成、促进血管平滑肌细胞的增殖等参与AS的形成。细胞自噬又称为Ⅱ型细胞死亡，是细胞在自噬相关基因的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。适度的自噬对AS具有保护作用，过度的自噬却会导致细胞死亡，不利于斑块的稳定性。近来的研究发现，ox-LDL能够诱导血管内皮细胞自噬，导致微管相关蛋白1轻链3（LC3）和Bcl-1表达增加。Martinet等研究发现，LDL、炎症以及氧化应激可以促进AS斑块中细胞的自噬。斑块细胞通过自噬降解受损伤的细胞器从而防止外部氧化应激损害。有实验结果显示，ox-LDL 100mg/L刺激细胞12小时后，细胞内SOD活力降低，MDA含量明显增多，造成内皮细胞氧化应激损伤。且发现ox-LDL能够诱导血管内皮细胞自噬。而与模型组相比，丹参酮ⅡA干预后细胞内MDA含量降低，SOD活力增高，血管内皮细胞自噬增强，表明丹参酮ⅡA能够促进氧化损伤的内皮细胞自噬活性。丹参酮ⅡA对EA. hy926细胞具有抗氧化应激损伤的作用且此作用可能通过诱导血管内皮细胞的自噬进而发挥。PI3K/Akt/mTOR信号通路，参与调控细胞的增殖、代谢、生长、分化、凋亡等多种生命现象，同时在炎症、肿瘤、代谢和心血管疾病的发病机制中起重要作用。Altman等研究发现氧化应激能够引起斑块细胞的自噬，其中PI3K/Akt/mTOR信号通路起到关键的调节作用。有研究表明，PI3K/Akt/mTOR信号通路是参与自噬调控的一个重要信号通路，在自噬调控中发挥着重要的作用。营养不足、缺氧、氧化应激等不利因素均会抑制PI3K的活性，从而使下游Akt活化减少，抑制细胞增殖，诱导细胞发生自噬和凋亡。王和峰等研究发现抑制PI3K能减少兔原代巨噬细胞自体吞噬。通过Ⅰ型PI3K激酶抑制剂LY294002阻断PI3K通路，能够部分抑制丹参酮ⅡA诱导的自噬，使mTOR和Akt磷酸化水平均减少，并且进一步导致MDA含量增高，SOD活力降低。说明丹参酮ⅡA通过PI3K/Akt/mTOR信号通路上调自噬，进而减轻ox-LDL诱导内皮细胞的氧化应激损伤。丹参酮ⅡA可能通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路促进自噬，对ox-LDL诱导的EA.Hy926细胞氧化应激损伤起到保护作用，进而防治AS。
AS的发生是由于血管内皮细胞和平滑肌细胞受到各种危险因子（如机械损伤、免疫复合物），特别是ox-LDL损伤，使血管局部产生一种过度慢性炎性增生反应，而在该生物学改变过程中，内皮细胞功能障碍是AS发生发展的重要基础病理改变，当内皮细胞出现形态结构受损和功能改变，血管屏障功能遭到破坏，血液中的脂质和单核细胞等则更容易沉积在内皮下间隙，进而形成泡沫细胞，导致AS等一系列病理损伤。ox-LDL作为导致血管内皮损伤的主要原因，可以通过直接损伤内皮细胞和与血凝素样氧化型低密度脂蛋白受体-1（LOX-1）结合两种途径诱导内皮细胞氧化应激损伤，进而促使白细胞黏附迁移、泡沫细胞形成、脂质沉积、平滑肌细胞增殖、血管收缩性改变、粥样斑块脆性增加及破裂等病理性损伤的发生，加速AS发展。因此，张妮选用ox-LDL诱导EA.hy926细胞形成氧化应激损伤模型，结果发现，与正常组比较，模型组MDA含量增高，SOD活力降低，说明模型组EA.hy926细胞发生了氧化应激损伤；而与模型组比较，丹参酮ⅡA+模型组MDA含量降低，SOD活力增高，说明丹参酮ⅡA对EA.hy926细胞具有抗氧化应激损伤的保护性作用。自噬是真核细胞特有的一种不同于凋亡的生命方式，是细胞通过溶酶体降解内源性底物的重要生物学过程，具有高度的进化保守性，对维持细胞结构、代谢和功能的平衡发挥着重要生物学作用。自噬与多种疾病的发生发展有着密切关系，在疾病进展的不同阶段对细胞所产生的影响是不同的，不同程度自噬对机体的作用亦是不同的。研究发现，适度自噬对AS具有保护作用，过度自噬却会导致细胞死亡，不利于斑块的稳定性。ox-LDL、内质网应激、炎症等与AS发生相关的因素均可促进斑块内细胞发生自噬。其中，有研究发现ox-LDL可以影响氧化应激，改变细胞内的钙离子浓度，激活内质网应激，诱导细胞凋亡，而在此过程中自噬也被激活，其机制可能是通过Ca2+/钙依赖蛋白激酶抑制mTOR的激活，进而激活自噬。此研究利用Western blot技术检测EA.hy926细胞LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ自噬小体蛋白表达情况，结果发现：与正常组比较，模型组自噬增强，自噬抑制剂3-MA组自噬减弱；与模型组比较，3-MA能够抑制模型组自噬水平。检测各组EA.hy926细胞MDA含量和SOD活力，结果发现：与模型组比较，模型+3-MA组MDA含量增高，SOD活力降低，说明抑制自噬可导致EA.hy926细胞氧化应激损伤增强，在本过程中模型组EA.hy926细胞因受到ox-LDL诱导而影响氧化应激，发生氧化应激损伤，反馈性的促使自噬激活，但被激活的自噬程度较低，尚未能够逆转其本身的氧化应激损伤，因此仍表现为氧化损伤；当于模型组加入自噬抑制剂3-MA时，EA.hy926细胞自噬明显受到抑制，氧化应激损伤增强。从以上结果可以看出，内皮细胞氧化应激损伤与自噬关系非常密切。进一步研究发现，与正常组比较，模型组和丹参酮ⅡA组自噬小体LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白表达增强，说明丹参酮ⅡA能够促进内皮细胞自噬；与模型组比较，丹参酮ⅡA+模型组自噬小体LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ蛋白表达进一步增强，说明丹参酮ⅡA能够促进氧化损伤的内皮细胞自噬活性。为进一步证实自噬增强在丹参酮ⅡA保护ox-LDL诱导EA.hy926细胞氧化应激损伤中的作用，结果发现：自噬抑制剂3-MA预处理后丹参酮ⅡA对ox-LDL诱导EA.hy926细胞氧化应激损伤的保护作用明显降低。进一步实验发现丹参酮ⅡA能够增强氧化应激损伤EA.hy926细胞自噬相关蛋白Atg3、Atg7、Atg5-Atg12、LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ的表达水平，说明丹参酮ⅡA能够促进氧化损伤内皮细胞自噬小体的形成；加入自噬抑制剂后，丹参酮ⅡA促进氧化损伤EA.hy926细胞自噬小体的形成过程受到抑制。结论：丹参酮ⅡA可能通过调节EA.hy926细胞自噬小体形成信号通路即Atg12-Atg5通路和LC3-PE通路相关蛋白，发挥其保护EA. hy926细胞抗氧化应激损伤的生物学活性，进而防治AS的发生发展。
第七节 铁死亡
一、定义
铁死亡是一种调节性细胞坏死方式，具有不同于凋亡、自噬的特征。在形态学上，其伴随质膜起泡、线粒体皱缩、嵴减少或消失和膜密度增加；在生化上，其伴随铁和自由基的聚集以及谷胱甘肽的耗竭，其发生过程可被亲脂性抗氧化剂、铁螯合剂抑制，但不可被凋亡、坏死和自噬等抑制剂所抑制，故为一种铁依赖性脂质过氧化导致的新型细胞死亡方式。其发生伴随铁依赖性脂质活性氧的积累和质膜多不饱和脂肪酸的消耗，涉及脂质代谢、氨基酸代谢和铁代谢三个过程。
二、铁死亡与心脑血管疾病危险因素
心脑血管疾病是以血管异常为诱因，以AS为病理基础的疾病，高血压、血脂异常、糖尿病等均会增加心脑血管疾病的发病率。目前尚无直接证据证明铁死亡参与AS的致病过程，但相关研究表明，动脉斑块的形成与血管内皮细胞的脂质过氧化、铁沉积及其损伤后的脂质沉积、微血管生成等有关。此外，Guo等发现，GPX4的过表达可抑制ApoE-/-小鼠中的斑块形成；Sakai等发现，GPX4缺失可诱导人脐静脉内皮细胞死亡，并且可被铁死亡特异性抑制剂Fer-1改善。
三、现代生物学基础之铁死亡
目前有研究证明铁死亡在心脑血管疾病的发生中发挥着重要作用。Baba等研究表明，铁死亡是心肌梗死区细胞死亡的重要原因，mTOR可通过调节ROS和铁的代谢来抑制成年小鼠心肌细胞的铁死亡过程。Li等研究发现，在心脏移植或心脏冠状动脉闭塞导致的再灌注损伤中，心肌细胞会发生铁死亡并释放炎症介质，激活TLR4/TRIF/I型IFN炎症信号通路，促进中性粒细胞与冠状动脉内皮细胞的黏附募集，加重心脏损伤；使用铁死亡抑制剂Fer-1后，可降低移植心脏中心肌细胞的肺动脉栓塞水平，减少心肌细胞铁死亡，缩小冠状动脉结扎诱导的心脏梗死面积，改善左室收缩功能并减少左室重构。Liu等研究表明，在压力超负荷介导的心力衰竭大鼠模型中伴随铁死亡的发生，葛根素可通过诱导铁蛋白FTH1和GPX4的生成以及降低ROS、NOX4的产生来抑制心肌细胞的铁死亡过程，改善大鼠模型的心脏功能。Zhang等发现ICH后24小时，脑组织中GPX4蛋白水平降低，通过Fer-1阻断铁死亡可改善脑损伤，因此GPX4可能通过介导铁死亡参与大鼠脑出血的继发性脑损伤，增加GPX4的表达可减轻ICH诱导的脑损伤。Xie等发现，铁死亡参与了创伤性脑出血的损伤过程，创伤性脑出血的发生会导致铁沉积，GPXs活性降低和ROS的积累；使用黄芩素和脑室注射Fer-1均可显著减轻组织损伤，改善大脑的认知功能。
现代医学研究认为，AS的发病机制涉及多种危险因素和复杂事件，主要是由于长期的血脂异常导致LDL尤其是被修饰的LDL等沉积于血管内膜，导致血管通透性改变，发生氧化应激反应，尤其是低氧因子作用下，通过氧化损伤导致各种急慢性炎性反应。ROS是线粒体进行能量代谢过程中形成的氧自由基以及衍生的氧化产物的统称，其比氧气具有化学活性，在动脉内皮损伤中发挥关键作用，包括引起内皮功能障碍、LDL氧化以及激活炎性反应。在ROS对血管内膜损伤过程中，会产生大量的不饱和脂肪酸代谢产物MDA，MDA为具有较强毒性的脂质自由基，能够进一步加剧内膜损伤，SOD则是清除氧自由基重要的金属抗氧化酶，SOD能够催化ROS产生歧化反应，从而清除氧自由基以减少对血管内膜的损伤。细胞内沉积的脂质过氧化主要是由GPX4将其还原为相应的醇或水，GSH是一种能够清除脂类氢过氧化物的抗氧化酶，GSH在GPX4的催化作用下，具有较强的抗氧化和清除脂质过氧化物的作用，而GSH的过度消耗则会导致GPX4不能催化GSH还原过氧化物，而加重氧化应激导致铁死亡的发生。胱氨酸主要用于细胞内GSH合成，而胱氨酸主要是由胱氨酸/谷氨酸反转运体系统中的轻链亚基（SLC7A11）将其从细胞外转运到细胞内，同时能够将细胞内的谷氨酸转移至细胞外，如果SLC7A11表达被抑制则会导致胱氨酸摄取不足，直接导致GSH合成减少，加剧氧化损伤并促进铁死亡形成，而细胞肿瘤抗原（p53）亦是SLC7A11重要的上游基因，能够直接抑制SLC7A11的表达，同时能够激活前列腺素G/H合酶2（PTGS2）表达，导致还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶1（NOX1）介导的脂质过氧化水平升高，增加ROS反应进而导致细胞发生铁死亡。杨关林教授团队在以氧化损伤诱导的铁死亡为切入点深入探讨痰瘀论治AS的理论内涵时发现，以健脾化痰、活血祛瘀为治法的二陈汤合桃红四物汤能够增加AS小鼠血清SOD和GSH水平，降低MDA水平，表明二陈汤合桃红四物汤能够改善AS小鼠氧化损伤水平，同时也检测了氧化损伤过程中与氧化自由基含量及氧化应激密切相关的基因NOX1、PTGS2 mRNA和COX2蛋白表达水平，发现二陈汤合桃红四物汤能够降低NOX1、PTGS2 mRNA和COX2蛋白表达水平，再次证明二陈汤合桃红四物汤能够改善AS小鼠氧化应激反应。为了证明本研究中氧化应激诱导了铁死亡的发生，本研究还检测了小鼠主动脉FTH1蛋白表达水平，FTH1具有铁氧化酶活性，可调控储存铁离子，对维持铁的稳态并将铁传递到细胞中发挥重要作用。FTH1 mRNA表达减少与铁死亡发生密切相关，最近研究发现，自噬增加可降解铁蛋白FTH1的表达从而增加铁水平，导致芬顿反应而发生氧化损伤。RT-PCR检测各组小鼠主动脉p53、SLC7A11、GPX4 mRNASA水平显示，二陈汤合桃红四物汤能够抑制p53 mRNA表达，同时增加SLC7A11、GPX4 mRNA水平。因此得出结论，二陈汤合桃红四物汤能明显改善情况，其机制可能与调控p53/SLC7A11介导的氧化损伤及抑制细胞铁死亡有关。
第八节 血管内皮结构和功能
一、血管内皮细胞的生理功能
血管内皮细胞主要由存在于心、血管和淋巴管内表面的扁平上皮细胞组成，是一层有活性的细胞，主要生理功能是屏障功能，是血液与血管壁之间的屏障，同时具有重要的内分泌功能，可合成和释放多种内皮衍生的血管活性因子，具有减少血管通透性、抑制细胞的迁移与趋化、调节血管收缩与舒张、抑制血小板聚集和抗黏附等多种生理功能。内皮功能受损是AS发生的首发步骤，且贯穿AS发生发展全过程。
二、影响血管内皮细胞功能障碍相关因子
AS过程开始于血管内皮细胞功能障碍。大多数心脑血管疾病的发病介质可激活内皮细胞，导致趋化因子、细胞因子、黏附分子和其他促炎因子表达显著增加。血管内皮细胞损伤、内皮功能障碍是AS的起始环节，其参与AS的启动和进展过程。内皮功能障碍及形态学损伤引起白细胞-内皮细胞黏附、血管收缩、血小板聚集、氧化应激、平滑肌增殖及血栓形成。
内皮细胞通过释放舒血管因子降低血管通透性，近年来研究证明NO是内皮细胞重要的舒血管因子。NO在扩张血管，抑制血小板黏附、聚集，抑制白细胞-内皮细胞黏附和平滑肌细胞增殖等方面发挥重要作用。NO通过环磷酸鸟苷介导使内皮细胞Ca2+减少，达到调节血管张力的目的。有研究表明，NO合成减少、生物利用度降低、NO通路功能障碍等参与AS的发病过程。
内皮素（ET）不仅存在于血管内皮，也广泛存在于各种组织和细胞中，是调节心血管功能的重要因子，在维持基础血管张力与心血管系统稳态发挥重要作用。ET是迄今所知最强的缩血管物质，NO是最重要的舒血管因子，两者认为是反映血管内皮功能的代表性指标。相关研究表明，促进损伤细胞NO分泌，抑制ET分泌，能维持血管收缩和舒张的平衡，提高各种抗氧化剂在体内活性，进而上调体内抗氧化系统的活性，清除过多自由基，降低细胞凋亡率，最终达到保护血管内皮细胞目的。
血管紧张素Ⅱ（AngⅡ）由内皮细胞将血液中的血管紧张素Ⅰ转化而来，参与肾素-血管紧张素-醛固酮系统（RAAS）组成。AngⅡ与血管紧张素1受体相结合，激活还原型辅酶Ⅱ氧化酶，从而产生活性氧，尤其是超氧阴离子。这些物质将NF-κB信号通路激活，诱导促炎性介质如iNOS、ICAM、TNF-α和其他趋化因子。因此AngⅡ及其产物是重要的细胞机制，在诱导血管壁损伤中起主要作用，引起氧化应激和血管炎症，导致血管内皮细胞功能障碍，并与AS发展有关。
血管内皮细胞损伤后，可分泌多种黏附分子，如VCAM-1、连接黏附分子（JAMs）、血小板-内皮细胞黏附分子-1等，均属于免疫球蛋白超家族，这些物质可趋化单核细胞及T淋巴细胞黏附于血管内皮。动脉硬化发生早期，白细胞黏附、聚集是一个重要环节，正常的血管内皮不与白细胞发生黏附，但在血管硬化部位白细胞黏附于内膜表面，并穿透内皮细胞间连接进入到内膜，内皮细胞表面表达的黏附分子参与白细胞进入内膜的过程。
血管内皮生长因子（VEGF）是由Ferrara和Henze首先在体外牛垂体滤泡细胞培养分离出的一种血管调节物质。VEGF是由两个相同多肽链以二硫键组成的同源二聚体糖蛋白，由内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞分泌产生，它能作用于内皮细胞，促进细胞有丝分裂进而引起血管新生，具有较强的特异性。VEGF具有增强血管通透性作用。当发生AS时，血管内皮细胞VEGF的表达会增加，诱导新生血管形成，血管壁的厚度就会增加，进一步促进AS的发展。
前列环素（PGI2）主要由血管内皮细胞产生，是血管平滑肌舒张剂和血小板聚集抑制剂，它是花生四烯酸的代谢产物，其半衰期短，是一种在局部起作用的不稳定活性物质。PGI2降解后形成稳定的6-酮-前列腺素，因此，临床上常通过6-酮-前列腺素反映PGI2的水平。PGI2是血栓素的对抗剂，通过激活腺苷酸环化酶，使血小板前列醇内cAMP含量增高，从而导致血管舒张反应、抑制炎症介质释放、拮抗血栓烷A2（TXA2）的缩血管和血小板聚集作用。生理状态下，PGI2和TXA2处于动态平衡，共同维持血管的正常生理功能。内皮功能障碍，PGI2和TXA2之间的平衡打破，引起血小板聚集、炎症介质增加，发生一系列病理反应，加速AS进展。
三、现代生物学基础之血管内皮结构和功能障碍
杨关林团队通过实验证明血管内皮结构和功能障碍是从脾论治心脑血管疾病的现代生物学基础之一，健脾化痰方能够有效改善高脂血症脾虚痰浊证小猪的血管内皮功能障碍。在制造高脂血症脾虚痰浊小型猪模型24周时，模型组血清和内皮组织匀浆中tNOS、iNOS水平均高于对照组，eNOS、NO水平低于对照组，提示高脂血症脾虚痰浊证小型猪血管内皮功能明显损伤；同时模型组血清和内皮组织匀浆中ET-1和ICAM-1水平均明显升高，再一次证明模型组小型猪血管内皮损伤并且存在血管炎症的发生。而给药组上述各指标虽较对照组差，但均较模型组明显改善，提示健脾化痰方能有效改善高脂血症脾虚痰浊证小型猪血管内皮功能，可能是其治疗高脂血症脾虚痰浊证的作用机制之一。进一步实验研究显示，与正常组比较，模型组NO水平显著降低、ET-1水平显著升高；与模型组比较，健脾化痰组小猪NO水平显著升高、ET-1水平显著降低；上述结果提示，模型组小猪血管内皮功能障碍，NO合成降低、ET-1生成增多，在高血脂的条件下，加速了血管内皮受损；而经过24周健脾化痰中药预防性治疗，健脾化痰组NO、ET-1水平均得到明显改善，其原因可能与应用健脾化痰中药治疗有关；经过健脾化痰方24周预防性治疗后，S1PR1、PI3K蛋白水平表达显著升高，Akt、eNOS蛋白磷酸化水平显著升高；以上结果提示，健脾化痰方可能通过上调S1PR1/PI3K/Akt/eNOS信号通路，改善血管内皮功能障碍。高脂血症脾虚痰浊证小型猪在第24周存在S1PR1/PI3K/Akt/eNOS信号通路表达水平改变，提示高脂血症脾虚痰浊证小型猪出现血管内皮功能障碍，健脾化痰方预防性治疗对高脂血症脾虚痰浊证小型猪血管内皮损伤具有保护作用，其机制可能是通过激活S1PR1/PI3K/Akt/eNOS信号通路实现的。
采用复合因素塑造大鼠脾气虚证模型，与正常组相比，模型组大鼠血管内皮因子发生明显变化，ET-1水平显著升高，NO含量有降低趋势，VEGF水平明显降低，提示脾气虚的发生与进展与血管内皮障碍具有相关性，推测虚-痰-瘀可能贯穿脾气虚的病机演变进程，脂质代谢异常所致的血管内皮功能障碍可能是“因痰致瘀”的现代医学本质。脾气虚证进程中会发生血管内皮功能变化，推测以脾气虚为肇始，进而痰浊留滞，因痰致瘀，痰瘀互结，致使脉道不利（血管功能紊乱），可能是病情发展的重要途径，而痰瘀的形成与血管内皮功能障碍密切相关。通过健脾化痰祛瘀法可改善脾气虚证的临床症状，调整脾气虚大鼠的血管内皮功能，减缓或抑制脾气虚证的演变进程。
第九节 氧自由基
一、定义
自由基，化学上也称为“游离基”，是含有一个不成对电子的原子团。由于原子形成分子时，化学键中电子必须成对出现，因此自由基就到处夺取其他物质的一个电子，使自己形成稳定的物质。在化学中，这种现象称为“氧化”。生物体系主要遇到的是氧自由基，例如超氧阴离子自由基、羟自由基、脂氧自由基等。加上过氧化氢、单线态氧和臭氧，通称ROS。体内ROS自由基具有一定的功能，如免疫和信号传导过程。但过多的ROS自由基就会有破坏行为，导致人体正常细胞和组织损坏，从而引起多种疾病。
二、脾与氧自由基
脾为后天之本，气血生化之源，脾主运化。脾失健运，痰浊内生。作为病理产物性病因之一，痰致病具有广泛性等特点，故有“百病多由痰作祟”之说。方永奇最早提出：自由基是一种由机体本身不停生成的病理产物，当这种病理产物与体内的大分子物质相结合后，所生成的过氧化物又变成新的病因造成其他病变。中医痰证理论与自由基的共同之处在于二者均为病理产物性病因，且两者均具有复杂性、广泛性和多变性的致病特点。李保东等通过检测和分析67例中风患者的自由基水平后发现中风病痰证组患者与非痰证组和对照组相比，其MDA含量明显升高，SOD含量明显降低。方永奇等研究证实痰证患者的过氧化脂质水平上升，而谷胱甘肽过氧化物酶及SOD含量降低。故可以通过测定机体内自由基的水平来间接地反映一个人体内“痰浊”的严重程度。
三、现代生物学基础之氧自由基
ROS是线粒体进行能量代谢过程中形成的氧自由基以及衍生的氧化产物的统称，其比氧气具有化学活性，在动脉内皮损伤中发挥关键作用，包括引起内皮功能障碍、低密度脂蛋白氧化以及激活炎性反应。在ROS对血管内膜损伤过程中，会产生大量的不饱和脂肪酸代谢产物MDA，MDA为具有较强毒性的脂质自由基，能够进一步加剧内膜损伤，SOD则是清除氧自由基重要的金属抗氧化酶，SOD能够催化ROS产生歧化反应，从而清除氧自由基以减少对血管内膜的损伤。细胞内沉积的脂质过氧化主要是由脂膜修复酶GPX4将其还原为相应的醇或水，GSH是一种能够清除脂类氢过氧化物的抗氧化酶，GSH在GPX4的催化作用下，具有较强的抗氧化和清除脂质过氧化物的作用，而GSH的过度消耗则会导致GPX4不能催化GSH还原过氧化物，而加重氧化应激。
氧化应激可以由ROS引发，当活性氧的产生过多和抗氧化系统之间出现了不平衡的现象时氧化应激产生，导致了细胞的损伤凋亡等。程岩岩等证明脾虚痰浊AS巴马小型猪模型可以对心肌线粒体造成氧化损伤，诱导凋亡。在AS过程当中，如果CAT、GSH-Px含量下降，会导致对自由基的清除能力下降，导致大量的氧自由基积蓄，细胞生物膜的功能被破坏，细胞受损伤，氧化应激作用增强，MDA等毒性物质增多。应用健脾化痰祛瘀方可以提高CAT、GSH-Px含量从而减少脂质过氧化物反应的最终产物MDA，从而减少氧化应激的损伤。本实验中，模型组巴马小型猪心肌Bax表达明显升高，而Bcl-2表达明显降低，Cyto C、Caspase3在心肌表达明显增加，说明脾虚痰浊AS可以降低Bcl-2/Bax的比值从而诱导细胞色素C从线粒体中的释放，激活Caspase3，诱导心肌细胞的凋亡。而健脾化痰祛瘀方治疗的脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌细胞Bax表达明显减低，Bcl-2表达明显升高，Cyto C表达显著减低，Caspase3在心肌表达明显减少，说明健脾化痰祛瘀法可以提高Bcl-2/Bax的比值从而抑制细胞色素C从线粒体中的释放，抑制Caspase3的生成，抑制心肌细胞的凋亡。脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌线粒体产生过多的氧自由基，氧自由基损伤可以使心肌组织的抗氧化系统失衡，过量的氧自由基作用于线粒体，破坏线粒体的内膜，破坏其功能，产生了氧化反应，破坏正常的心肌组织。由此可见，健脾化痰祛瘀方能够减少脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌自由基的生成，同时能够增强清除自由基的防御体系，从而达到提高线粒体的氧化功能来减少氧化损伤，减少线粒体内的氧化应激及其造成的线粒体损伤，减少心肌细胞的凋亡，起到保护心肌的作用。
第十节 血液流变学
一、定义
血液流变学是生物力学及生物流变学的分支，是研究血液宏观流动性质，人和动物体内血液流动和细胞变形，以及血液与血管、心脏之间相互作用，血细胞流动性质及生物化学成分的一门科学。
血液流变学主要是研究血液及其有形成分的流动性和形变规律。高脂血症、高血压、CHD等心脑血管疾病和血液流变改变关系密切。血液流变异常，必然会引起机体内血液循环障碍，血液黏度是重要参考指标。血液黏度的高低与血液运输和血液供应的多少有密切关系。血液黏度升高，则血管阻力增加，减缓了血流速度，会使器官和组织缺血缺氧，影响组织的代谢和功能。如高血压、CHD、糖尿病、周围血管病等，均与血液黏度异常有关。
二、AS与血液流变学
AS虽与脂类代谢密不可分，但与血液流变学也是密切相关的。大量研究显示，高脂血症患者血脂水平与血流变指标存在正相关。高脂血症患者血液中过多的脂质沉积至血管内皮下，巨噬细胞在病灶局部聚集，使血管平滑肌细胞演变成泡沫细胞，形成粥样斑块，血管壁不光滑，血液流经该处，流变改变也影响血液黏度。血脂异常既能使血液黏度增高，又能影响血细胞、血小板和多种细胞的聚集。一方面，高胆固醇使得红细胞膜脂质失衡，红细胞变形能力下降，刚性增加，红细胞膜流动性下降，引起全血高切黏度增加，血流阻力增加，其中红细胞的变形能力是决定红细胞能否通过毛细血管的决定因素，血脂的异常造成血细胞结构和功能的变化从而影响微循环，造成微循环障碍、组织缺血缺氧；另一方面，在低切变率下，血细胞容易形成体聚集和叠连，血液黏度增高使得血细胞聚集性增加，血流阻力增加。血清胆固醇浓度升高还可引起血小板膜组成变化，使其对血管壁的黏附性增强，引起血液呈高凝、高黏状态最终导致血栓形成和微循环障碍，这些因素都加速了AS的形成。因此有效降低血脂和改善血液流变学可延缓或逆转AS等病症的发生发展。
三、脾与血液流变学
宗文九最早提出：痰证的产生可能与AS斑块有关。李以义提出迫使“津液”离开常道而成痰浊正是血黏度增高、微循环障碍所导致的。方永奇通过实验研究表明血液流变性的改变是痰证的血液循环基础。温化冰通过观察和对比119例瘀血证和痰瘀证患者的血液流变改变后发现：痰证患者主要体现在血液凝聚方面的异常，并且认为“痰可致瘀”，即瘀血证与痰证二者存在着相同的病理基础。王静怡等通过系统观察305例痰湿及痰湿夹瘀证患者的血液流变学相关指标后，得出了与温化冰相一致的结论。方永奇等通过研究后提出心血管病痰证的一大特点是血液黏滞度和聚集性的增高，并进一步指出可将红细胞聚集指数和全血比黏度作为诊断痰证的现代生物学指标。方显明通过测定和分析45例CHD痰证患者的6项血液流变学指标后提出：CHD痰证的主要血液理化基础是血浆黏滞性的升高和红细胞聚集性的加强。王琦等研究了痰湿体质患者血液流变学及甲皱微循环的变化特点。其中血液流变学实验结果提示痰证患者与非痰证患者相比，红细胞电泳时间和全血黏度的低切率值显著增高；甲皱微循环检查表明：痰湿型体质者的确存在着微循环障碍。贺劲通过观察368例CHD患者的血液流变学指标后发现痰证患者的确存在着微循环障碍。任建勋等在研究中发现，痰瘀组凝血酶原时间、血浆纤维蛋白原含量均高于对照组。痰和瘀分别可视为津液和血运行的病理状态，张介宾有“血浊气浊凝聚而为痰”的论述，肥胖人痰湿体质血液流态性改变包含了津液和血的病理状态，再次证实了血浊凝聚可以为痰、痰浊聚集亦可致瘀的痰中挟瘀、痰可致瘀的理论。
四、现代生物学基础之血液流变学
血液流变学的异常、血液黏度增高、血小板聚集性增强是动脉硬化性心脑血管病发生的重要因素。毛秀菊等通过观察抗AS1号方对血脂及血液流变学的影响中，应用健脾化痰、破血散瘀药物结果显示：治疗组治疗后全血高切、低切黏度及血浆黏度、红细胞聚集指数、血小板聚集率均显著下降，与对照组比较差异有显著性，因此得出：从脾论治改善高脂血症患者血脂及血液流变性具有防治AS的作用。
高脂血症可增加红细胞膜微黏度，导致血液流速下降，进而使组织缺氧缺血，出现机体代谢异常。全血黏度ηb是表示血液总体流动性的指标，ηb增高表示血液黏滞性增加而流动性降低。不同的切变速度反映血液在体内不同粗细、不同压差的血管中的流动性。血浆黏度ηp增加的直接原因是血浆纤维蛋白原或大分子球蛋白增加或血脂显著增加。红细胞压积HCT是一个非常重要的血流变指标，该指标增加时ηb各指标都可能增加。红细胞聚集指数RAI增高，多见于红细胞膜的性质结构异常性疾病，可导致低切变率下血液黏度增高。抑制ηb、ηP、HCT、RAI的升高，从而改善红细胞的变形性和由于脂质代谢失调和血脂异常导致的血液流变学紊乱。通过改善血浆黏度值，提高红细胞变形能力，使红细胞携带与释放氧的速度变快，达到有效缓解缺氧状态的目的；红细胞聚集指数降低，则血流速度增快，血液内皮细胞等不易沉积在血管内膜上，可改善血管狭窄状态，有效防止血栓的发生。此外，降低血液黏度值及红细胞压积，还可以达到增加脑血流量、改善脑部微循环的作用。任琳君研究发现，与正常对照组比较，高脂模型组中全血黏度低、中、高切及血浆黏度均显著升高，全血还原黏度显著升高，红细胞聚集指数及红细胞变形指数升高。灌胃给药干预后，与高脂模型组比较，山楂绞股蓝汤高、中、低剂量组全血黏度在低、中、高切下均极显著性降低；全血还原黏度在低、中、高切下均显著降低；红细胞聚集指数极显著性降低；红细胞变性指数均显著降低。由此得出：山楂绞股蓝汤可以从脾论治改善高脂血症大鼠血液流变学障碍，增加组织器官的血液供应，改善心、脑血管疾病的症状。
第十一节 血管周围脂肪组织
一、定义
血管周围脂肪组织（PVAT）指紧绕血管周围的脂肪组织，以往认为血管周围脂肪组织是与血管伴行起支撑保护作用的结缔组织。近年来研究表明，PVAT中不仅含有脂肪细胞，而且含有多种免疫细胞，具有支撑血管、储存能量和内分泌功能，可分泌多种脂肪因子和细胞因子，调节血管和全身的免疫微环境。PVAT功能的异常与高血压、AS等多种心血管疾病的发生发展关系密切。
血管周围脂肪主要由脂肪细胞、成纤维细胞、干细胞、肥大细胞以及神经细胞等构成。除脑血管外，全身各处血管（大到主动脉，小到真皮层微血管）周围都存在脂肪细胞。早在2005年，发表于《柳叶刀》上的一篇文章中提出，PVAT是联系内脏脂肪、胰岛素抵抗以及血管疾病的重要枢纽，在肥胖相关性疾病中起到重要作用。由于PVAT所处部位的特殊性，它既有内脏脂肪的功能，可分泌大量脂肪因子及细胞因子，同时它又可以通过多种途径调节血管的功能。PVAT分泌瘦素、脂联素、抵抗素和血管活性物质，从而发挥抗炎作用，抑制AS发生发展。
二、AS与血管周围脂肪组织
PVAT因其特殊的解剖位置，引起学者们的关注，与AS病变的严重程度密切相关，因而被认为是新的危险标志。PVAT随着伴行血管的不同，脂肪成分及功能也存在差异。脂肪组织主要分为白色脂肪组织（WAT）及棕色脂肪组织（BAT），大血管周围PVAT兼有WAT及BAT特征，阻力血管外周脂肪主要是WAT。WAT细胞内可见单个较大脂滴，生理功能是以脂肪形式储存能量。BAT细胞内可见多个较小脂滴，此外细胞内含有大量的线粒体，主要功能是消耗脂肪并发挥非颤抖产热作用。BAT有两种类型，肩胛间区的BAT为经典BAT，而其他部位的BAT为米色脂肪组织。米色脂肪组织的功能及形态类似于BAT，被称为棕色化的脂肪组织，但细胞来源与BAT不同，米色脂肪细胞来源于白色脂肪细胞前体或成熟白色脂肪细胞。胸主动脉周围PVAT中主要为米色脂肪组织，腹主动脉周围PVAT中兼有WAT以及米色脂肪组织。解偶联蛋白1（UCP1）是米色脂肪的表达特异性基因，可用于区分WAT和米色脂肪组织。
PVAT细胞分化过程及相关调控机制已经成为研究脂肪沉积的核心。多项研究证实高脂饮食可导致PVAT的体积增大，这与脂肪细胞的增多以及脂肪细胞体积的增大相关，而脂肪细胞数目的增多主要依靠脂肪前体细胞的分化增殖。白色脂肪细胞前体可分化为成熟WAT细胞，也可分化为米色脂肪细胞，当PVAT细胞过度分化时脂肪细胞体积增加或脂肪细胞数目增多，血管周围脂肪沉积加重，并促进PVAT中脂肪细胞向WAT细胞分化，并抑制米色脂肪细胞的形成，使得米色脂肪细胞减少，WAT细胞增多，PVAT细胞成分和分子特性改变，导致血管保护性脂肪源性舒张因子以及抗炎性脂肪因子脂联素产生减少和促炎性因子如抵抗素、瘦素，细胞因子IL-6、TNF-α等产生增加。PVAT细胞分泌的各种脂肪细胞因子可通过旁分泌效应，以“由外而内”的方式浸润进入血管内膜，使与之毗邻的血管发生病变，造成血管功能障碍，血管内脂肪组织过度沉积，引起AS的发生发展并加重斑块的不稳定性，是发生AS的独立危险因素。
过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）有PPARγ1和PPARγ2两种亚型，在脂肪细胞分化的过程中起着重要的开关作用，是脂肪组织生长发育的主要调控及转录因子。几乎所有前体脂肪细胞特异的基因在脂肪细胞终末分化时都受到PPARγ的调控，同时PPARγ也可作为脂肪细胞分化的标志基因。PVAT细胞分化是血管周围脂肪间充质干细胞在各种因素的作用下，经过脂肪母细胞、前体脂肪细胞和不成熟的脂肪细胞3个阶段后，逐渐分化形成成熟的脂肪细胞过程。在此过程中，PPARγ可以与视黄醇类X受体（RXRα）形成异源二聚体，该异源二聚体结合到下游靶基因启动子区过氧化物酶体增值物元件（PP RE）上，诱导其表达，调控靶基因的转录，PPARγ又能够与CCAAT增强子结合蛋白α（C/EBPα）相互诱导彼此的表达，并形成正反馈通路，维持两者的高水平表达，从而对脂肪细胞分化过程进行调控。
现在越来越多的miRNA被发现参与到脂肪细胞的分化调控过程，其中，miRNA-27作为重要的调控因子，在脂肪细胞分化过程中发挥至关重要的作用。miRNA-27家族包括miRNA-27a和miRNA-27b两个亚型，两者来源于不同的转录体，决定了功能的相互独立性。有研究通过复制冠脉AS巴马小型猪模型，应用二代测序的方法对血清的MicroRNA进行了生物信息学分析，筛选中发现差异表达的miRNA-27。在探索靶向于过氧化体增殖物激活型受体PPARγ的miRNA研究中，利用Cytoscape及其插件构建miRNA与PPARγ的作用网络，筛选出靶向PPARγ的关键miRNA，通过生物信息学分析发现，miRNA-27对PPARγ的调控作用较强。更有大量研究表明，miRNA-27a和miRNA-27b可靶向调控PPARγ。脂肪细胞的分化程度越高，miRNA-27的表达量越低，过表达的miRNA-27结合PPARγ可抑制脂肪细胞分化。miRNA-27可通过下调PPARγ的表达进而抑制脂肪细胞的分化。
三、现代生物学基础之血管周围脂肪组织
尽管PVAT在AS发病机制中的作用已被广泛研究，但它们在非AS性血管疾病中的作用，例如内膜增生、腹主动脉瘤（AAA）以及动脉僵硬和血管炎，受到的关注较少。但有数据表明，功能障碍的PVAT可能与这些疾病有潜在的联系，这些疾病也通常以血管壁炎症、氧化应激、VSMC表型转换和新生血管形成为特征。
有研究发现HFD喂养的肥胖小鼠PVAT可通过eNOS解偶联来增加AAA的形成，这表明PVAT的功能障碍在肥胖状态下对形成AAA发挥作用。同样，将内脏脂肪组织移植到ApoE基因被敲除小鼠的腹主动脉上，发现通过AT1a受体信号通路可促进AAA的形成，这表明主动脉周围的脂肪组织在AAA发病机制中起重要作用；但其没有使用真正的PVAT进行移植。也有报道称，血小板衍生生长因子-D（PDGF-D）在肥胖小鼠PVAT中的高度表达会促进AAA的形成。在脂肪细胞上表达的CCL5可以增加T细胞的浸润，促进AAA的形成，表明血管周围脂肪细胞和免疫细胞之间的交互作用在AAA的发病机制中起重要作用。基于人体的研究数据表明，主动脉硬度与PVAT的数量呈正相关，而与体重指数无关，PVAT源的IL-6与人类主动脉硬度和脉搏波速度的增加相关。几项研究还表明PVAT和血管炎综合征之间存在关联，如Takayasu动脉炎，在弹性大动脉内的肉芽肿堆积。Takayasu动脉炎患者会表现出更高水平的瘦素和抵抗素，这与炎症标记物（如Pentraxin-3）的表达增加有关。
脂肪营养不良是一种脂肪组织数量严重减少的疾病状态，可促进胰岛素抵抗和高血压，与过度肥胖患者通常表现相似。鉴于血管周围脂肪细胞与血管外膜相邻，并在血管反应性和高血压中发挥调节作用，因此推测脂肪营养不良患者的高血压可能与PVAT的减少或缺失有关。实验动物模型中的脂肪组织消融产生了严重的胰岛素抵抗、血脂异常和肝脏脂肪变性，这为研究脂肪营养不良的全身心血管效应提供了一个模型。有研究者使用无白色脂肪组织、PVAT和棕色脂肪组织显著减少的脂肪萎缩性A-ZIP/F1转基因小鼠研究PVAT在血管功能中的作用，这些脂肪萎缩的小鼠表现出了胰岛素抵抗和高血压，结果表明这与缺乏PVAT和上调AT1受体的表达有关。SMPG基因被敲除的小鼠完全没有PVAT，但有正常的白色脂肪组织和棕色脂肪组织，同样显示出高血压和动脉僵硬增加。另一方面，低灌注诱导形成的AAA可通过去除PVAT而减少，同时血管壁中间充质干细胞的数量也会减少。总之，营养不良状态下的PVAT萎缩可通过多种机制以复杂的方式影响血管功能和疾病状态，阐明其可能有助于我们进一步了解代谢性疾病、高血压、血管僵硬和重塑等。
第十二节 肠道菌群
一、定义
肠道菌群，人体肠道的正常微生物，如双歧杆菌、乳酸杆菌等能合成多种人体生长发育必需的维生素，如B族维生素（维生素B1、B2、B6、B12），维生素K，烟酸、泛酸等，还能利用蛋白质残渣合成必需氨基酸，如天门冬氨酸、苯丙氨酸、缬氨酸和苏氨酸等，并参与糖类和蛋白质的代谢，同时还能促进铁、镁、锌等矿物元素的吸收。人体肠道内寄生着10万亿个细菌，它们能影响体重和消化能力、抵御感染和自体免疫疾病的患病风险，还能控制人体对癌症治疗药物的反应。
二、脾与肠道菌群
现在医学界基本把肠道菌群看作人体的一个器官。肠道不仅仅有消化、吸收功能，它还是人体内最大的免疫器官，也是人体最大的排毒器官。肠道菌群影响着宿主的营养吸收、代谢，对身体的免疫系统也有巨大的影响。中医的脾是“主运化”食物的，也就是胃负责受承食物，把食物变成食糜，然后是脾把食物转化分解，变成我们能吸收的状态，然后脾把其中的营养精微吸收，运送全身，这叫“运化”。那么，在这个运化的过程中，我们会发现多数工作是肠道菌群完成的，尤其是“化”这个部分，甚至还包括一部分的“运”。
补脾的中药，比如怀山药、白术等，都可以提供有益菌所喜欢的营养物质，可以促进有益菌的生长，因此可以起到补脾的作用，这至少是补脾的一部分内容；而一些清除湿热的药物，比如黄连等，具有杀灭害菌的作用，因此也起到补脾的作用。肠道菌群还影响我们的口味、食欲等，比如给喜欢吃肉的人移植了吃素的人的肠道菌群后，这些吃肉的人开始喜欢吃素。所以，我们喜欢吃什么，很可能是受肠道菌群的影响。
中医认为“脾主思”，而思虑过度也会伤脾。那么，脾和思虑真的有什么关系吗？这点，从肠道菌群的角度来看也能得到部分答案。在西医里，有一个说法叫“肠脑”，就是现在越来越发现肠道和情感是相通的。研究显示，肠道菌群影响我们的性格，人们首先在动物研究中发现了这个特点，服用益生菌的小白鼠在危险环境里会显得更加积极。美国加州大学洛杉矶分校对人也进行了一项研究，他们把女性分成三组，一组服用富含益生菌的酸奶，第二组吃没有益生菌的奶制品，第三组正常饮食。结果4周后，经常服用益生菌的人比其他两组的大脑活动都更加积极。然后更有趣的事情出现了，研究人员把两种性格的小白鼠的肠道菌群互换，结果害羞的小白鼠变得外向，而外向的小白鼠变得害羞了。肠道和情感是如此相通。所以，从肠道菌群的角度来看中医的“脾”，会有更多的维度。
三、冠心病与肠道菌群
CHD患者的肠道微生物群存在差异，这已成为共识。研究表明，肠道微生物群与肥胖、糖尿病、血脂异常和高血压有关，这些都是CHD的危险因素。肠道微生物群通过其代谢产物参与介导胆固醇代谢、尿酸代谢、氧化应激和炎症反应等基本代谢过程，可诱导AS和CHD的发生。干扰肠道微生物群的组成，补充益生菌和粪便捐赠是潜在预防和治疗CHD热门研究领域。
2004年Bäckhed等首先报道了肠道微生物群与肥胖有关，他们发现肠道微生物群可以调节实验小鼠的脂肪储存。在人和小鼠中都发现了与肥胖相关的相似肠道菌群。在肥胖的小鼠和肥胖的人类肠道微生物群中，厚壁菌/拟杆菌比例更高。结果表明，肥胖患者的微生物组从饮食中获取能量的能力更强。这一发现进一步证实了肠道菌群与肥胖之间的关系。
目前的研究表明，肠道菌群可能导致肥胖。肠道微生物群会发酵宿主无法消化的物质，将其转化为小分子，如短链脂肪酸（SCFA），并为宿主提供能量。肠道菌群抑制禁食诱导的脂肪细胞因子（FIAF）表达，增加脂蛋白脂肪酶表达，并促进脂肪细胞中甘油三酸酯储存[（乙酰辅酶A羧化酶（ACC）和脂肪酸合成酶（FAS）是关键的调节剂）]，诱发肥胖。肠道菌群还调节内源性大麻素（CB）系统。CB调节肠的通透性以及肠黏膜中紧密连接蛋白的定植和分布，从而导致肠通透性增强，脂多糖和炎症反应增加，导致肥胖。
糖尿病是CHD的主要危险因素。糖尿病患者的CHD发病率为55％，是非糖尿病患者的几倍。糖尿病的发病机制与环境因素和宿主遗传有关。作为重要的环境因素，肠道菌群与糖尿病密切相关。在人类粪便微生物群的研究中，这些有益细菌与改善胰岛素敏感性和改善糖尿病有关。增加糖尿病风险的细菌是有害的。对我国345例糖尿病患者肠道微生物DNA的基因组学分析显示，中度菌群失调是2型糖尿病患者正常菌群平衡受到干扰的状态。为了对2型糖尿病患者的肠道微生物含量进行分析，开展了一个全基因组关联研究（MGWAS），并根据shotgun法对来自345位中国人的肠道微生物DNA进行了两阶段的MGWAS分析。此外，共生丁酸产生菌数量减少，而条件致病菌的数量增加。对145名欧洲糖尿病女性的肠道菌群进行的研究得出相似结果：产生丁酸的梭状芽孢杆菌数量减少，而乳酸杆菌属和链球菌属增加。普氏菌（Prevotella copri）和普通拟杆菌（Bacteroides vulgatus）是支链氨基酸合成与胰岛素抵抗之间联系的驱动因素。胰岛素抵抗者的血清代谢组的特征是支链氨基酸（BCAAS）含量升高，已证明Prevotella copri可以诱导胰岛素抵抗，加重葡萄糖耐量和增加小鼠BCAA循环水平。普通拟杆菌可以引起胰岛素抵抗并增加循环支链氨基酸水平，从而介导糖尿病。许多研究表明，肠道菌群通过影响胰岛素抵抗和胰岛素分泌失调来促进糖尿病。
肠道菌群与2型糖尿病之间的重要联系是Toll样受体（TLR）。肠道菌群的变化通过调节TLR4参与胰岛素抵抗诱导的肥胖。来自肠道菌群的LPS通过肠道吸收进入血液循环，这一过程称为代谢性内毒素血症。TLR4缺失对胰岛素抵抗的保护作用与其对代谢性内毒素血症信号转导的抑制有关。LPS可以促进胰岛B细胞凋亡并减少胰岛素分泌。肠道菌群失衡会导致短链脂肪酸（SCFA）失调，这在调节肠道菌群，维持体液平衡，为肠上皮提供能量，抑制炎症因子形成以及促进肠黏膜修复方面起着重要的作用。增加的SCFA可以诱导TLR4信使RNA表达显著增加，并增强NF-κB与白介素（IL）-6结合。SCFA与G蛋白偶联受体41/43结合也可影响抗炎和脑肠肽激素分泌功能，导致胰岛素抵抗和胰岛细胞功能障碍，并导致胰岛素样生长因子-1（GLP-1）分泌障碍（例如GLP-1可降低血糖和胰岛细胞凋亡）。此外，肠道菌群的结构和体内稳态变化会改变胆汁酸转化，从而导致异常的TGR5和法尼醇X受体（FXR）信号通路。这种变化会导致代谢紊乱，最终导致糖尿病。
血脂异常与CHD密切相关。饮食、肥胖、激素、基因和其他因素会导致血脂异常。肠道菌群的生理和代谢活动对于调节和维持人类平衡的脂质代谢至关重要。厚壁菌和拟杆菌属是影响血脂改变的主要细菌菌群。肠道菌群的脂质代谢产物[例如胆碱、三甲胺氧化物（TMAO）和甜菜碱]会促进AS并增加患心血管疾病的风险。肠道菌群会影响血清甘油三酯和高密度脂蛋白胆固醇的转化。
首先，肠道菌群产生胆汁盐羟化酶，将结合的胆汁酸转化为二级游离胆汁酸。二级游离胆汁酸可通过G蛋白偶联受体调节肝脏和脂质的代谢，肠道菌群紊乱可导致胆汁酸分泌异常，从而引起血脂异常。其次，肠道菌群将胆碱和肉碱从宿主转化为三甲胺（TMA），而TMA在肝脏中转化为TMAO。TMAO可通过影响胆固醇的运输和代谢以及胆汁酸水平而引起血脂异常和AS斑块。第三，SCFAS可以抑制肝脏脂肪合成酶的活性，调节血液和肝脏中胆固醇的分布，从而在降低血清3-酰基甘油和胆固醇水平方面发挥作用。细菌异常会导致SCFA分泌不足和血脂异常。益生菌可以降低血清胆固醇并增加高密度脂蛋白含量，表明正常的肠道菌群间接地参与了血脂水平的降低。
对原发性高血压大鼠粪便细菌的分析表明，细菌数量和多样性明显降低。厚壁菌和拟杆菌的比例增加，SCFA产量降低。SCFA可通过与嗅觉受体78（OLFR78），G蛋白偶联受体41（GPR41）和G蛋白偶联受体43（GPR43）结合来调节血压。SCFA在维持肠上皮屏障功能中发挥作用。它们可以减少炎症反应，直接影响免疫细胞，减少交感神经活动，从而改善高血压。此外，一项研究还报道了肠道菌群可以影响血管活性激素（如5-羟色胺，多巴胺和去甲肾上腺素）的形成，从而在调节血压中发挥作用。一项对高血压患者的粪便菌群进行了分析，发现类似的结果。普雷沃氏菌和克雷伯氏菌的比例显著增加。将健康对照组和高血压组的肠道菌群移植到GF小鼠体内。用高血压患者粪便细菌移植治疗的小鼠血压显著升高。表明肠道微生物群与宿主的血压有关，并进一步证实不平衡的肠道微生物群是高血压的重要致病因素。
肠道微生物群参与调节基本代谢过程，如胆固醇代谢、尿酸代谢、氧化应激和炎症反应，通过其代谢物，可导致AS和CHD的发展。2012年，Karlssion等使用全基因组测序来确定肠道菌群变化与CHD之间的可能联系。与健康人群相比，Collinsella菌的数量增加，而Rothia和Eubacterium菌数量减少。使用宏基因组技术进行的进一步功能分析表明，CHD患者肠道菌群中编码肽聚糖合成的基因增加，而编码八氢番茄红素去饱和酶的基因（与血清中β-胡萝卜素减少相关）减少。2016年，Emoto等使用末端限制性片段长度多态性（T-RFLP）和16S rRNA来研究CHD患者和健康志愿者之间肠道菌群的差异。结果表明，在CHD患者中，成熟的乳杆菌数量显著增加，而拟杆菌（双歧杆菌和普氏杆菌）显著下降。此外，厚壁菌/拟杆菌的比例明显增加。该研究还发现，不使用抗生素的CHD患者肠道菌群中乳酸菌的比例显著增加，而拟杆菌的比例显著下降。2017年，这些作者在两项临床试验中再次验证了这些结果。首次将肠道菌群结构的变化直接鉴定为CHD的诊断标记。
肠道菌群产生的代谢性TMAO是心血管疾病的关键机制。食物中的胆碱[如，磷脂酰胆碱，胆碱，L-肉碱和其他三甲胺（TMA）]通过肠道微生物酶复合物来产生TMA。然后TMA进入门静脉循环，并被宿主的肝酶进一步代谢，从而产生TMAO。研究表明，血浆TMAO水平与CHD风险高度相关。临床研究表明，TMAO增加了患心血管疾病的风险，并增加了急性心肌梗死、心源性休克和死亡的发生率。一项为期3年的研究（涉及4007名参与者）进行了选择性冠状动脉造影术。结果表明，空腹血浆TMAO水平在独立于传统心血管危险因素的心脏事件预测中发挥作用。这项研究表明，最高四分位数患者中，TMAO水平较高的患者恶性心脏事件的发生率比最低四分位数患者高2.5倍。而且，TMAO的风险比显著高于低密度脂蛋白的风险比。校正传统的危险因素和肾功能后，TMAO水平仍是恶性心血管事件的独立预测因子。
Cyp7al是胆汁酸合成中的主要酶。Cyp7al的表达上调可以帮助扩大胆汁酸库，增加胆固醇的运输，并最终减少AS斑块的形成。TMAO可以降低Cyp7al的表达，抑制胆固醇的运输，引起胆固醇在细胞中的积累，并导致形成泡沫细胞。TMAO还可以诱导血小板反应过度，因此成为AS的危险因素。TMAO与血小板之间的相互作用可能通过改变血小板依赖性钙信号传导而促进血小板高反应性并增强体内血栓形成。据报道血小板高反应性是心血管事件的危险因素。最近的证据表明，TMAO可以在数分钟内迅速向细胞发送信号。在内皮或平滑肌细胞中，TMAO可以迅速诱导丝裂原活化的蛋白激酶和NF-κB活化，并引起下游黏附分子的上调。TMAO水平升高还与SMAD 3蛋白的磷酸化增加有关。SMAD 3是转化生长因子β（TGF-beta）途径中的关键信号。在动物模型中，TMAO促进血管炎症并诱导主动脉内皮细胞活化和黏附蛋白上调。这些作用都是急性冠状动脉综合征的关键机制。
血清尿酸水平可能是CHD的独立危险因素。尿酸在体内具有氧化特性。血尿酸水平升高会导致血尿酸增加氧自由基，氧化应激，血管内皮功能障碍，炎症反应以及AS的发展。肠道菌群通过调节尿酸代谢来影响氧化应激过程。大肠杆菌含量越高，尿酸分解越多。CHD患者血清尿酸水平升高与肠道菌群功能障碍有关。高尿酸血症也是AS的危险因素。血清尿酸水平升高会增加氧自由基的产生，引起氧化应激，并引起内皮功能障碍。UA水平与循环类胡萝卜素成负相关。与年龄、性别、总能量、蛋白质和维生素摄入量无关，循环尿酸水平与总类胡萝卜素（尤其是α-胡萝卜素、番茄红素、叶黄素、玉米黄质和硒）呈负相关。类胡萝卜素作为抗氧化剂，具有抗心绞痛的作用。一项研究分析了AS患者和正常对照组的肠道菌群结构，发现AS患者的肠道菌群富含编码肽聚糖生物合成的基因，而正常对照组的肠道菌群富含类胡萝卜素编码基因。肠道微生物疾病会导致含有合成类胡萝卜素基因的细菌减少，从而降低血液中的类胡萝卜素水平并削弱抗氧化作用，从而促进AS发展。
肠道菌群失衡与CHD的发病机制有关。这是一种有效的靶向疗法，但缺乏与CHD和心肌梗死患者干预相关的数据。Lam等使用抗生素抑制肠道菌群，并观察这些变化对急性心肌梗死（AMI）小鼠预后的影响。结果表明，肠道菌群变化与心肌梗死之间存在联系，并证明益生菌补充剂可以减少心肌梗死率。Gan等研究了给予益生菌以减轻心肌梗死后心肌肥大的小鼠。作者确定，干扰肠道菌群结构并改善急性心肌梗死的预后可能成为AMI的新疗法。
在当前的临床实践中，益生元和益生菌是调节肠道菌群失衡的主要治疗工具。为了确定益生菌是否可以改变心肌梗死后患者的预后，研究人员建立了大鼠心肌梗死模型，并在大鼠饮用水中随机给予GR-1或安慰剂和益生菌。16S rRNA用于对大鼠盲肠微生物组成进行测序，两组之间无明显差异。但是，心钠素的基因表达有所不同。接受GR-1的动物的左心室肥厚较轻，血液动力学参数更好。停止使用益生菌后的4周，两组仍然存在差异，表明在治疗结束后GR-1的作用仍然存在。益生菌可以用作预防CHD和改善心肌梗死患者预后的潜在疗法。益生元作为发酵底物，可以增强有益肠道菌群的活性，并有效改善血糖控制和血浆脂质分布。此外，益生元还可以改善肠道通透性，减少代谢性内毒素血症，减轻炎症，缓解糖尿病患者对葡萄糖不耐的症状。
研究人员认为，粪便捐赠是一种治疗由于微生物引起的肠外疾病的新疗法。研究表明，健康人向代谢综合征男性患者捐赠粪便样本后，在6周后就会增加胰岛素敏感性和丁酸水平。但是，该研究并未证实改善肠道菌群结构是否可以预防冠状AS或降低AMI发生率。需要大样本的前瞻性队列研究来进一步探讨肠道菌群与CHD之间是否存在因果关系。最近，研究人员发现DMB可以抑制TMA的产生。抑制TMA的产生可降低小鼠的TMAO水平和AS斑块形成，且无不良反应。此外，在一些天然安全食品中也富含DMB，例如醋、红酒、初榨橄榄油和葡萄籽。因此，可以通过食用DMB胆碱来调节潜在的AS来防止TMA产生。
CHD患者的肠道菌群存在差异。无菌小鼠模型和菌群基因组学技术的出现可以帮助确定肠道菌群与CHD之间的关系，并将肠道菌群研究的准确性提高到菌株水平。
第十三节 蛋白质组学
一、定义
蛋白质组学（Proteomics），是以蛋白质组为研究对象，研究细胞、组织或生物体蛋白质组成及其变化规律的科学。蛋白质组（Proteome）一词，源于蛋白质（Protein）与基因组（Genome）两个词的组合，意指“一种基因组所表达的全套蛋白质”，即包括一种细胞乃至一种生物所表达的全部蛋白质。蛋白质组学本质上指的是在大规模水平上研究蛋白质的特征，包括蛋白质的表达水平，翻译后的修饰，蛋白与蛋白相互作用等，由此获得蛋白质水平上的关于疾病发生，细胞代谢等过程的整体而全面的认识。
二、冠心病与蛋白质组学
蛋白质组学可为CHD的诊断治疗提供辅助依据，同时也为中医学研究CHD“证”之间存在的差异提供了技术支持。对不同证候的样本进行蛋白质组学研究，筛选出差异蛋白，可研究该蛋白能否作为该证候诊断的金标准。
CHD是本虚标实、虚实夹杂的复合性疾病，标实以血瘀、痰饮、痰瘀为主，其中血瘀是CHD致病的关键，也是CHD最常见、最多发的中医证型。痰证和痰瘀互结证在发病早期所占比例较少，但随病情演变，中后期以痰证和痰瘀互结证为主。CHD血瘀证为目前研究热点之一，研究发现与正常人比较，血瘀证存在凝血功能异常、血脂异常及炎症反应异常，具体表现为全血黏度增高，血小板活化，血流动力降低，血液处于高凝状态。以上可作为CHD血瘀证辨证的依据。李雪峰等运用MALDI-TOF-MS技术检测CHD心血瘀证患者与正常患者的血浆样本，发现CD41和Actinγ等7种差异蛋白，并认为CD41和Actinγ有望成为CHD心血瘀证的标记蛋白。周倩倩等通过MALDI-TOF-MS技术检测CHD心血瘀证患者和正常人的血浆样本，发现差异蛋白为视黄醇结合蛋白、结合珠蛋白、血清白蛋白、载脂蛋白。赵慧辉等应用HDMS与UPLC联用检测CHD心血瘀证患者和健康人血浆样本，发现上调蛋白13种，根据功能分为急性时相反应蛋白、补体蛋白、细胞骨架蛋白、凝血相关蛋白；下调蛋白12种，根据功能分为载脂蛋白、运输蛋白、抗凝血相关蛋白、免疫球蛋白、细胞骨架调控蛋白。肖隋熙等应用iTRAQ技术检测78例CHD心血瘀证患者和34例CHD非心血瘀证患者的血浆差异蛋白质，发现11个上调的差异蛋白和16个下调的差异蛋白。其差异蛋白功能主要涉及细胞迁移、细胞损伤表达、细胞变性等。
CHD痰证与血瘀证的共同特点为凝血、脂质代谢紊乱，但两者在蛋白质组学表达方面均有侧重，痰证以脂质代谢异常所导致的“高脂”为主要特点，血瘀证以凝血系统紊乱为主。朱明丹等采用ESI-MS技术对CHD心气虚证、心肾阴虚证、痰浊内阻证、心血瘀证各9例患者的血清样本进行蛋白质组学研究，发现与血瘀证比较，痰证上调蛋白为血清淀粉样P物质、载脂蛋白E、凝溶胶蛋白亚型1、巨噬细胞刺激蛋白1、载脂蛋白H，下调蛋白为α-2-巨球蛋白、补体C4、补体成分C3、抗凝血酶Ⅲ。宋剑南等利用双向凝胶电泳-质谱技术检测痰证、血瘀证、痰瘀证患者和正常人的血浆样本，发现痰证与血瘀证的差异蛋白为结合珠蛋白前体、肾上腺髓质素结合蛋白前体、白蛋白、补体C4。CHD痰证主要体现在脂质代谢（载脂蛋白E、载脂蛋白H等）、免疫系统（巨噬细胞刺激蛋白1）、凋亡系统（凝溶胶蛋白亚型1）异常，而血瘀证主要体现在补体（补体C4、补体成分C3）、凝血系统（抗凝血酶Ⅲ）等异常。
痰瘀互结证与痰证、血瘀证比较，其特点表现为凝血、脂质代谢进一步紊乱，血液处于高凝、高脂状态，血流动力进一步降低。“高脂、高凝”可能为CHD痰瘀互结证的特点。苗兰等采用双向凝胶电泳、基质辅助激光解析-飞行时间质谱技术检测小型猪CHD痰瘀证的心肌组织，结果显示：与正常组比较，小型猪CHD痰瘀证载脂蛋白E升高，补体C4降低。宋剑南等发现与痰证比较，痰瘀互结证的上调蛋白为纤维蛋白原β链、白蛋白、补体C4、血红蛋白结合蛋白前体、结合珠蛋白前体，下调蛋白为载脂蛋白AI前体、α-1抗胰蛋白酶片段、簇连蛋白前体等。说明痰瘀互结证、痰证差异蛋白体现在凝血系统（纤维蛋白原β链）、补体系统（补体C4）、脂质代谢（载脂蛋白AI前体、载脂蛋白E）、血浆转运蛋白（白蛋白）、炎症反应相关蛋白（α-1抗胰蛋白酶片段、血红蛋白结合蛋白前体）等方面。从初期血瘀证到中期痰证及痰瘀互结证，CHD主要以脂质代谢指标升高、凝血等指标下降为主要表现。该结论可能与疾病传变存在一定关联，血瘀证引起气血的停滞，气滞无力推动津液运行，或血瘀迫津外出，导致痰浊的内停；而痰浊内停也会引起气血津液的停滞，最终引起血瘀证的发生或加重，两者导致疾病螺旋发展，最终形成“痰瘀互结证”。“痰”和“瘀”在病理上互有侧重，如痰证在脂质代谢异常方面较明显，可能由于痰浊内停，损伤脾阳，导致运化功能失常，从而导致人体脂质代谢功能的紊乱；而凝血系统异常主要以血瘀证、痰瘀互结证较明显，可能因为血瘀导致气血流动不畅，血流动力下降引起血液黏稠，进而导致凝血、补体指标升高。
CHD病机为本虚标实、虚实夹杂，本虚以心气虚证、心肾阴虚证为主，其发病初期比例低于血瘀证，但是随着疾病的发展，后期主要以心肾阴虚证、气虚证等虚证为主。王刚等采用荧光差异蛋白电泳、质谱技术检测CHD心血瘀证与心肾阴虚证患者的血浆差异蛋白，结果显示：与心肾阴虚证比较，心血瘀证患者的α2巨球蛋白、载脂蛋白A1、载脂蛋白E、补体C3、补体C1q亚成分亚基C、血红素结合蛋白和激肽酶蛋白含量较高，而聚集素、血清淀粉样P物质含量较低。朱明丹等发现，与心肾阴虚证比较，CHD血瘀证的上调蛋白为血红素结合蛋白、载脂蛋白E、α2巨球蛋白、载脂蛋白A-I、补体C1、载脂蛋白4前体、补体C3、激肽酶-1蛋白，下调蛋白为聚集素、血清淀粉样P物质。上述2项研究结果大致相同，说明CHD心肾阴虚与血瘀证的差异蛋白为补体C3、补体C1、载脂蛋白A1、载脂蛋白4前体、载脂蛋白E、α2巨球蛋白、激肽酶-1蛋白、血红素结合蛋白、聚集素、血清淀粉样P物质，其差异蛋白主要涉及补体系统（补体C3、补体C1）、脂质代谢（载脂蛋白A1、载脂蛋白4前体、载脂蛋白E）、激肽释放酶-激肽系统（激肽酶-1蛋白）、阿尔茨海默信号通路（聚集素、血清淀粉样P物质），可用于作为辨别心血瘀证与心肾阴虚证的指标，同时其含量的降低可能为心肾阴虚证形成的内在基础。
袁宏伟等采用双向电泳-质谱技术对CHD心气虚证和心肾阴虚证患者的血浆进行分析，结果显示，与心肾阴虚证比较，心气虚证患者的上调蛋白为血红素结合蛋白、补体C7、补体C3、补体C4-A、凝血酶原、血浆血管舒缓素，下调蛋白为α2巨球蛋白、富含组氨酸糖蛋白、载脂蛋白4前体、甘露糖结合蛋白C、载脂蛋白D、载脂蛋白A-I、活化T细胞核因子5亚型b、纤溶酶原、补体因子H亚型1。朱明丹等发现，与心血瘀证比较，气虚证患者的上调蛋白为补体C3、α2巨球蛋白、补体C4-A、血红素结合蛋白、补体C7、结合珠蛋白亚型1、血浆血管舒缓素、抗凝血酶Ⅲ，下调蛋白为CPN1、羧肽酶N催化链、聚集素。以上2项研究说明气虚证补体C3、补体C4-A、补体C7、血红素结合蛋白、血浆血管舒缓素的含量低于血瘀证、心肾阴虚证；差异指标主要涉及补体（补体C3、补体C4-A、补体C7）、激肽系统（血浆血管舒缓素）及炎症反应相关蛋白（血红素结合蛋白）；血瘀证、气虚证以上指标存在一定差异，可能为初期以血瘀证为主，血瘀导致气血津液的停滞，故会导致补体、激肽、免疫系统异常，以及炎症相关蛋白、脂质代谢紊乱等蛋白质异常；而血瘀日久，耗伤正气，最终由实转虚，属于由实转虚的过程，故其病理特点并非器质性病变，而是以气虚无力固摄血液的生理性改变，故凝血因子含量会有所下降；同时气虚不能固表，卫气亏虚导致了自身免疫功能下降，推断出CHD后期气虚证的主要特征为炎症反应、免疫系统、脂质代谢等方面的蛋白质含量降低。
目前CHD中医证候蛋白质组学在实验中已经初步揭示出正常人、CHD患者及其不同证型之间的差异蛋白，一定程度上说明蛋白组学与中医证候演变的相关性，可为以后研究疾病演变规律及证的本质研究提供数据基础。蛋白质组学虽能检测出差异蛋白，但是目前技术仍存在一定局限性。
第十四节 代谢组学
一、定义
代谢组学（Metabolomics）是对细胞、生物流体、组织或生物体内的小分子（通常称为代谢物，Metabolites）的大规模研究。这些小分子及其在生物系统中的相互作用统称为代谢组。能够对生物样本中的代谢物进行全面分析的一项新兴技术，被定义为代谢组学技术。
代谢组学是在后基因组学时代兴起的一门跨领域学科，其主要目标是定量研究生命体对外界刺激、病理生理变化以及本身基因突变而产生的体内代谢物水平的多元动态反应。代谢组学诞生于上个世纪末，之后迅速发展并渗透到多项领域，比如疾病诊断、医药研制开发、营养食品科学、毒理学、环境学，植物学等与领域。
发展至今，代谢组学技术已经远远超出了标准临床化学技术的范围，能够精确分析数百至数千种代谢物。代谢组学提供了代谢表型的详细表征，并可以在许多水平上进行精密医学研究，包括表征疾病基础的代谢紊乱，发现新的治疗靶标以及发现可用于诊断疾病或监测治疗药物的活性。常见代谢组学分析方法是质谱（MS）磁共振（NMR）光谱。质谱技术又分为LC-MS和GC-MS。其基本原理是使试样中各组分在离子源中发生电离，生成不同荷质比的带电荷的离子，经加速电场的作用，形成离子束，进入质量分析器。在质量分析器中，再利用电场和磁场使发生相反的速度色散，将它们分别聚焦而得到质谱图，从而确定其质量（质荷比），并通过质荷比的强度进行定量或半定量分析。NMR则是一种基于外部磁场变化引起的原子核能量吸收和再发射原理的光谱技术。NMR产生的光谱数据可用于量化浓度和表征代谢物的化学结构。
代谢组学技术的选择主要基于研究目的、样品类型等。NMR所需的样品制备较少，且产生的光谱与化合物浓度呈线性关系。但是，NMR的灵敏度相对较低，通常只能检测到最丰富的物种并且检测物质种类少，需要较长的纯化过程等因素限制了该方法的大面积使用。而质谱技术结合有效的样品前处理，以及与色谱分离相结合，具有很高的灵敏度和特异性，以及良好的动态水平，使得质谱尤其是高分辨LC-MS特别适用于非靶向和靶向代谢组学。
二、冠心病与代谢组学
脂质代谢物是生理和病理过程不可或缺的调控因素，血清总胆固醇和低密度脂蛋白-胆固醇（LDL-C）已被确定为CHD的危险因素，将CHD患者的血样进行脂质谱分析，CHD患者和对照组之间进行一个多变量分析，两组显示存在明显的分离。AS引起的代谢扰动，如棕榈酸酯、硬脂酸酯和1-单内酯甘油酯等。特别是棕榈酸盐，被证实作为AS临床诊断的生物标记物。早期尝试研究心血管疾病的代谢概况时使用的技术是NMR。一项较早的研究就是应用这项技术将患有严重CHD的36个人血清同30个冠状动脉造影正常者的血清相比较，显示这两组的光谱特性有显著差异。在主要脂质区域发现几个有差别的波峰谱，显示胆碱物质的代谢可能具有诊断意义。然而，随后的一项独立研究使用了类似的实验方法，在性别或使用他汀等因素校正后发现特定峰值与心血管疾病关联就很弱。在最近一些较大的研究中，应用目标串联质谱方法，用于分析45种血浆酰基类和15种氨基酸。为了数据简化，使用主成分分析法，发现支链氨基酸（BCAAS）及其相关代谢物和尿素循环的代谢物（包括精氨酸瓜氨酸）与CHD相关。以上表明，即使在传统心血管危险因素调整后，研究所涉及的与CHD相关的代谢物质与传统因素相比在区别CHD的危险性上具有更高的价值。
Park等将CHD和正常人群作对照实验发现：游离脂肪酸、包含不饱和脂肪酸的溶血卵磷脂和包含不饱和脂肪酸的溶血磷脂酰乙醇胺的水平在CHD患者中都高于正常对照组，然而包含饱和脂肪酸的溶血卵磷脂和烷化溶血磷脂的水平在CHD患者中低于正常对照组。另一项研究发现在饮食、肠道菌群、宿主代谢和心血管事件风险代谢生物标记物中存在一定的联系。研究发现主要和胆碱代谢的中间体有关，主要为胆碱、甜菜碱和氧化三甲胺。饮食和肠道菌群是密切相关的，是因为富含油脂的食物含有磷脂酰胆碱，能转换自由胆碱然后通过肠道代谢分解成三甲胺。甜菜碱也是通过存在在线粒体中的两种酶由胆碱衍生而来。因为三甲胺进入了循环，通过肝黄素单氧酶进一步代谢为氧化三甲胺，机体代谢必定会受影响。重要的是，研究者应用针对性液相色谱质谱分析（于1876例经过心脏评估的入选患者中进一步分析胆碱、甜菜碱和氧化三甲胺。发现这些代谢物即使在调整传统因素后和包括周围血管疾病在内的心血管疾病仍有很强的联系。另一项研究把发生心血管事件的病例211例与对照组216例进行脂质分离，对比发现溶血磷脂酰胆碱（LPC）16∶0和LPC20∶4，与降低CHD的风险有关，而鞘磷脂（SM）38∶2则增加了CHD的风险。
辨证论治是中医学理论的基本特点之一，由于证候是一个非线性的“内实外虚”“动态时空”和“多维界面”，具有复杂多变性，使中医证候本质的研究较难进行。代谢组学的特点与研究方法与中医学理论不谋而合，为中医证本质研究提供新的见解。CHD中医证候研究是近来国内代谢组学研究最为活跃的领域之一，通过代谢组学分析，CHD中医证候的内在实质和演变规律得到科学阐释。如王伟课题组利用NMR技术检测CHD患者及健康者的血浆和尿液代谢物，CHD患者的异常代谢过程包括了氨基酸、糖、脂质及能量代谢等，获得CHD血瘀证两种潜在标记物：缬氨酸和丙酮，CHD血瘀证的异常代谢过程主要包括了氨基酸代谢、脂质代谢；CHD不稳定心绞痛血瘀证患者在糖类、脂质物质以及氨基酸代谢方面存在异常，尿液样品中柠檬酸、脯氨酸、异亮氨酸、牛磺酸等代谢物的改变构成了CHD不稳定型绞痛血瘀证患者的代谢组学特征。另外，课题组还利用GC-MS技术对27例CHD血瘀证患者和15名健康者进行代谢组学分析并与MI猪模型比较，有20个代谢物对分类有贡献，其中1-4-苯二甲酸、1-5-脱水葡萄糖醇、壬二酸、庚二酸、戊二酸、核糖醇、丝氨酸等8种代谢物是人与模型猪共有的，在代谢组学对CHD血瘀证发病机制研究中建立了临床病例与动物模型之间的桥梁。王东生课题组采用GC-MS技术，收集CHD血瘀证患者48例，非血瘀证患者52例及健康对照组40例，发现血浆内源性代谢物种类46种。MCTree结果显示，健康对照组与CHD患者血浆代谢物完全分离，对二者分离贡献最大是L-缬氨酸、甘氨酸、丙氨酸、L-丝氨酸；血瘀证与非血瘀证之间有明显分离趋势，44种物质对分类有影响。这些物质包括脂肪酸类、酯类、氨基酸类、糖类、醇类、醇酸类、有机酸类等。另外，利用GC-MS测定CHD痰浊证和气虚证患者的血浆内源性代谢物，MCTree分析结果显示两种证型可被分开，对分类贡献大的化合物有丝氨酸、缬氨酸、2-羟基丙酸等。课题组采用LC-Q-TOF/MS技术对CHD血瘀证和痰浊证患者进行研究，结果显示26种差异性代谢物（VIP＞1.5，P＜0.05）对CHD及健康人分类有贡献，涉及炎症、氨基酸代谢和能量代谢等通路。19种差异性代谢物对CHD血瘀证和痰浊证分类贡献大。
代谢组学由于方法学上的独特优势，在CHD研究中已取得较多成果，可作为CHD诊治手段的有益补充。通过与中医学理论结合，为CHD中医微观辨证提供客观依据。然而，目前代谢组学技术上还存在一些不足，如在代谢物提取方面缺少系统化的方法，尚不能对生物体所有的代谢物进行检测和分析，只能提取浓度较高的代谢物，导致检测特异性降低；代谢物往往受诸如年龄、性别、生活方式、合并症、药物、饮食等因素影响，大多研究未排除上述混杂因素对代谢物的影响，需要有效的统计学方法和生物信息学方法。这些不足在CHD的代谢组学研究中同样存在。CHD中医证候研究尚处于起步阶段，多数研究停留在证候与几个代谢物的相关性层面上，未建立代谢物与基因，蛋白之间相互作用的网络模型，不能体现系统生物学整合性的研究思想，离CHD中医证型诊断模型的建立尚有一段距离。此外，CHD中医证候的代谢组学研究多采用横向研究方法，缺乏随时间变化的动态研究。最后，研究样本量少，缺少验证研究等问题值得关注。不可否认的是，代谢组学的特点及其研究思路、方法为中医证候本质的研究带来了新的机遇，尤其在CHD辨证论治、中药药效等方面研究中发挥着重要作用。建立多层次的组学技术平台，发展更为广谱的、即时、通用的检测方法，进行多组学数据的融合、关联分析等，对揭示中医证候本质具有十分重要的意义。