从脾论治AS与细胞焦亡机制相关研究

AS（Atherosclerosis，AS）是心血管疾病发病的病理基础，炎症反应是促进AS形成和进展的关键。细胞焦亡作为一种新的促炎形式的细胞死亡，逐渐成为人们关注的热点。细胞焦亡的特征在于孔道形成，质膜破裂，细胞内容物和促炎症介质释放到细胞间质，导致炎症和细胞死亡，该过程主要通过调控炎症小体来实现。目前已经证实可以发生焦亡的细胞类型主要有单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、血管平滑肌细胞、血管内皮细胞等。研究表明，细胞焦亡在AS的发生发展中起着重要作用，因此，探究细胞焦亡在AS中的作用和分子机制至关重要，为心血管疾病的预防或治疗提供新的靶点。研究指出，在AS早期，斑块中巨噬细胞死亡可以降低炎症反应，但在AS晚期，大量巨噬细胞死亡会促进坏死核心的形成，导致斑块的稳定下降，且释放的炎症因子加重炎症反应，导致斑块破裂、血栓形成，出现急性心肌梗死等急性心血管事件。因此，从调控巨噬细胞焦亡的角度干预AS的发生、发展，成为近年来的心血管领域研究热点。巨噬细胞焦亡致AS，其关键为炎症反应，通过巨噬细胞焦亡释放大量炎症因子，加剧AS进展。而在中医学中，可将“炎症”归于毒邪范畴，而毒邪可转化为痰浊，并阻滞血脉，导致脉道不利，则形成AS。这与炎症反应所致AS的过程基本一致。由此可见，脾虚生痰和巨噬细胞焦亡对于AS均具有重要意义。

曲宁宁等围绕化瘀祛痰方对AS家兔心肌组织细胞焦亡的影响开展了实验研究，健康SPF级雄性新西兰白兔45只，随机分为正常组、模型组、化瘀祛痰方组，每组15只。正常组喂饲普通饲料，其余两组喂饲高脂饲料，自由摄食，饮水不限。8周后，化瘀祛痰方组灌胃给予化瘀祛痰方16g/（kg·d），正常组与模型组灌胃给予同体积的蒸馏水8mL/（kg·d），连续给药4周。HE及Masson染色观察心肌组织形态变化，ELISA法检测血清及心肌IL-18和IL-1β含量，Western blot检测心肌细胞焦亡相关蛋白表达。细胞焦亡由两种Caspase介导，包括Caspase-1和Caspase-4/5/11。Caspase-1是最早被发现的一个Caspase家族成员，由炎性小体的复合物在感知病原信号后激活，是细胞天然免疫过程中最为重要的通路之一。炎性小体是由细胞质内模式识别受体（Pattern recognition receptors，PRRs）参与组装形成的多蛋白复合体。目前研究较多的且与细胞焦亡相关的NLR家族炎性小体有NLRP1、NLRP3和NLRC4。NNLRP3是目前研究最为深入的一种炎性小体，它通过识别PAMPs和DAMPs，与ASC相结合，并招募pro-Caspase-1，形成NLRP3炎性小体，进而使Caspase-1活化。NLRP3炎性小体是具有最广泛激活剂的炎性小体。AIM2是第一个被鉴定的非NLR家族蛋白，但它是形成炎性小体的重要成员。AIM2由配体经多个结合位点聚集而形成，具有两个特征性结构域：一个N端PYD结构域和一个C端HIN200结构域。AIM2炎性小体由AIM2、ASC和Caspase-1组成，AIM2通过PYD-PYD相互作用而与ASC结合，然后募集pro-Caspase-1，促进Caspase-1的激活以及IL-1β和IL-18的成熟。另外，GSMDM在2015年被发现，是炎性Caspase的一个底物。GSDMD属于一个功能未知的Gasdermin蛋白家族，Gasdermin蛋白家族的N端大都可以引发细胞焦亡，并最终通过启动细胞焦亡而激活天然免疫反应。继往有学者通过CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在小鼠巨噬细胞中针对Caspase-1和Caspase-11介导的细胞焦亡通路，分别进行了全基因组范围的遗传筛选，发现所有炎性Caspase的一个共同底物蛋白是GSDMD，该蛋白质的切割对于炎性Caspase激活引发细胞焦亡具有重要作用；这一研究证明了Gasdermin蛋白家族具有诱导细胞焦亡的功能，并且是细胞焦亡的直接和最终执行者。本研究结果表明，AS家兔心肌发生了缺血的变化，在此过程中有细胞焦亡参与，模型家兔心肌组织及血清IL-18和IL-1β较正常组均升高，经化瘀祛痰方干预后下降；并且模型家兔细胞焦亡相关蛋白AIM2、CASP1、GSDMD及NALP3表达较正常组上升，提示细胞焦亡可以分别通过炎性小体AIM2及NALP3分别介导CASP1蛋白的激活，并且激活GSDMD蛋白诱导细胞焦亡。经过化瘀祛痰方干预后发现CASP1、GSDMD及NALP3蛋白表达均下降，提示化瘀祛痰方能有效抑制细胞焦亡水平，化瘀祛痰方可以改善AS家兔心肌组织的变化，其机制可能与调节细胞焦亡存在密切关系。