从脾论治AS与PCR array技术相关研究
PCR Array技术是指PCR列阵或功能分类芯片技术，它结合了实时定量PCR技术灵敏可靠地优势以及微列阵技术同时检测多种基因表达量的优势，主要用于检测某信号通路或某生物学功能相关的一系列重要基因的表达量变化。本节中研究者们主要利用了AS家兔模型以及脾虚痰浊AS巴马小型猪模型开展研究，研究的PCR Array通路主要集中于线粒体能量代谢通路与AS信号通路。
（一）AS家兔模型
曹媛等利用PCR Array技术围绕化瘀祛痰方对AS家兔小肠组织线粒体能量代谢相关基因的影响开展了实验研究。采用45只健康SPF级雄性新西兰白兔，随机分为正常组、模型组、化瘀祛痰方组。模型组、化瘀祛痰方组予高脂饲料喂养造模。8周后，化瘀祛痰方组给予药物干预，剂量为16g/（kg·d），正常组与模型组给予相应体积0.9%氯化钠溶液。用药4周后检测家兔血脂水平、小肠组织形态学变化，PCR Array技术检测与线粒体能量代谢相关基因的变化。结果发现化瘀祛痰方对模型组异常的血脂水平具有调节作用。形态学结果显示，化瘀祛痰方组家兔小肠脂肪空泡与脂质沉积减少。芯片上包含84个与线粒体能量代谢相关基因，其中，正常组与模型组以及化瘀祛痰方组与模型组之间比较均发生上调≥2倍或下调≤2倍的基因共15个基因，这15个基因分别能够调控线粒体呼吸链上几种复合物酶。其中，ATP5G1、ATP5G2、ATP5J2、ATP6V0A2属于ATP合成酶亚基；LOC100340645是细胞色素C氧化酶亚基；LOC100343982、UQCRC1、UQCRQ为编码泛醌-细胞色素C还原酶的基因；NDUFA3、NDUFAB1、NDUFB2、NDUFB5、NDUFC2、NDUFS6为NADH酶亚基；SDHC为琥珀酸脱氢酶复合物亚基。该实验研究认为，小肠线粒体能量代谢相关基因表达异常极有可能是AS的潜在机制，也可能是化瘀祛痰方防治AS的重要作用靶点。
吴瑾等利用上述模型动物，利用PCR Array技术探讨了健脾化瘀祛痰方对AS家兔主动脉线粒体能量代谢相关基因mRNA表达的影响。实验造模方法同上，取材后采用全自动生化分析仪检测各组家兔血脂水平；油红O染色和天狼星红染色观察主动脉斑块脂质沉积和血管胶原成分；PCR Array技术检测主动脉线粒体能量代谢相关基因的mRNA表达。结果发现化瘀祛痰方对模型组异常的血脂水平具有调节作用。油红O染色可见，对照组动脉管壁未见脂质形成；模型组动脉管壁AS区域可见大面积红色脂滴阳性染色；中药组鲜红色脂质沉积区域明显减少。天狼星染色结果显示，对照组家兔主动脉血管内胶原分布致密、均匀、排列整齐，呈红色；模型组家兔主动脉血管胶原成分减少，呈疏松网状分布，且有部分断裂；中药组家兔主动脉血管胶原分布较规则，胶原之间的腔隙较少，血管结构部分发生改变。PCR Array结果显示中药组与模型组相比下调≥4倍的基因有ARRDC3、ATP5C1、COX4I1LOC100343255、NDUFA6、NDUFS2、NDUFS3、NDUFS4、NDUFV2、SDHB、SDHC、SDHD、SLC25A25、UQCRQ等21个基因。该实验发现健脾化瘀祛痰方可改善AS家兔主动脉线粒体能量代谢相关基因mRNA的表达，这可能是其降低AS家兔血脂含量，减少主动脉斑块沉积的潜在机制之一。
（二）脾虚痰浊AS巴马小型猪模型
刘晶晶等利用PCR Array技术围绕健脾祛痰化瘀方对脾虚痰浊AS巴马小型猪主动脉AS信号通路相关基因表达的影响开展了实验研究。实验将15只巴马小型猪随机分为正常组、模型组和治疗组，每组5只，正常组普通饲料喂养，模型与治疗组给予高热量高脂饲料喂养并进行冠脉球囊挤压伴拉伤及跑步措施进行干预至24周，制备巴马小型猪病症结合脾虚痰浊AS模型，治疗组除上述造模措施外给予健脾祛痰化瘀方灌胃24周。呼吸机麻醉后取材，提取各组主动脉总RNA，应用AS信号通路PCR芯片检测健脾祛痰化瘀方对脾虚痰浊AS巴马小型猪主动脉AS信号通路相关基因mRNA表达变化的影响。PCR Array结果显示：与正常组比较，模型组巴马小型猪上调≥2倍的基因有14个，占16%；下调≥2倍的基因16个，占18%。与模型组相比，治疗组巴马小型猪上调≥2倍的基因有14个，占16%；下调≥2倍的基因11个，占13%。其中在模型组/正常组上调而在治疗组/模型组下调的基因有10个，其中应激反应基因2个（Tnf、Sele），细胞凋亡基因2个（Bax、Il1a），血液凝固和循环基因1个（Ace），黏附分子基因1个（Selplg），细胞外分子基因3个（Mmp1、Col3a1、Lif），脂质转运与代谢基因1个（Ptgs1）；在模型组/正常组下调而治疗组/模型组上调的基因有5个，细胞凋亡基因1个（Bcl2a1），血液凝固和循环基因2个（Pdgfa、Fn1），脂质转运与代谢基因2个（Ldl-R、Ppara）。随着近些年对AS研究的不断深入，发现在AS发生发展过程中，从脂质条纹到纤维斑块以及最后形成的粥样斑块，甚至不稳定斑块的形成、破裂，始终都贯穿各种炎症细胞以及炎症介质的参与。Tnf是一种具有多种生物学活性的细胞因子，其中主要由单核-巨噬细胞分泌的Tnf-α在发生AS时，血液中的合成量明显增加，且影响着AS的发展。AS一旦发生，作为前炎症因子的Tnf-α，一方面可以通过诱导急性炎症因子C-反应蛋白（Crp）产生黏附分子，黏附分子Icam-1可以引起白细胞向炎症反应部位募集，从而加重AS的产生，另一方面可以通过抑制血管平滑肌细胞胶原基因的表达，导致其发生凋亡，使斑块不稳定性增加，进一步激活炎症细胞，诱导细胞外基质金属蛋白水解酶Mmps的产生，Mmps不但可使基质降解，还参加新生血管的重构，当胶原的合成与降解的平衡被打破后，会引起AS斑块纤维冒的破裂，出现溃疡，进而加重斑块的易损性。血脂水平升高也是AS发病的一个重要危险因素，Ldl-R作为血浆中重要的TC转运蛋白，可以与载脂蛋白B（Apo B）和E（Apo E）结合，介导极低密度脂蛋白（VLDL）和低密度脂蛋白（LDL）的清除，以此起到调节血浆TC浓度的作用，Apo E和LDLR双基因缺失小鼠患高脂血症和AS的概率大大提高；Apo CⅢ和Ldl-R双基因缺失小鼠血浆中抗氧化物质还原性谷胱甘肽水平显著降低。有研究表明，辛伐他汀降脂作用可能是通过影响Ppara基因多态性从而激活Cyp3a4酶活性实现的。除此之外，肾素血管紧张素醛固酮系统（RAAS）在AS发生发展过程中也扮演着重要角色，血管紧张素转换酶（Ace）是RAAS中一个完整的酶，抑制Ace活性可以减轻AS。该研究认为健脾祛痰化瘀方可能参与调控主动脉AS信号通路中脂质代谢与凋亡等相关基因表达从而起到防治脾虚痰浊AS巴马小型猪AS形成及稳定斑块的作用。
王俊岩等利用PCR Array技术围绕脾虚痰浊AS巴马小型猪冠状AS相关基因差异性表达开展了实验研究。实验随机将10只健康的广西巴马小型猪分为正常组和模型组，每组5只，正常组给予普通饲料饲喂，模型组给予球囊拉伤术联合高脂饮食饲喂进行脾虚痰浊AS模型复制，实验24周后，观察巴马小型猪行为学变化。呼吸机麻醉后取材，分离血清和冠状动脉，测定血清血脂、hs-CRP、IL-6水平，HE染色观察冠状动脉组织形态学变化，对模型进行评价。应用PCR array技术观察巴马小型猪冠脉应激反应与脂质转运和代谢相关基因变化。结果发现，造模24周后，巴马小型猪出现食少且不欲饮食、神疲乏力、倦怠等明显脾虚证候，与正常组比较，模型组血清血脂、hs-CRP、IL-6水平显著升高，HE染色结果表明，模型组小型猪血管内膜损伤严重，提示模型复制成功。研究选用Pig atherosclerosis array芯片，芯片上包括与应激反应相关基因25个，与脂质转运和代谢相关基因15个，其中3个基因与二者均有密切联系，结果显示，模型组小型巴马猪与应激反应相关的25个基因中，IL1R1、C6、CCL5、CCL11、CCR1、TNF、CSF2、IFNγ、SELE、APOE、IL4等11个水平显著升高，VWF、PPARγ、NOS3等3个基因水平显著下调；与脂质转运和代谢相关基因15个中，APOE、NR1H3、IL4、PTGS1、PPARD等5个基因水平显著升高，FABP3、LPL、PPARγ、APOB、LDLR等5个基因水平显著下调。作者进一步采用RT-PCR对变化显著的部分基因进行验证，并得到了与芯片检测相一致的结果，表明芯片筛选结果真实可靠。研究认为脾虚痰浊巴马小型猪冠脉应激反应与脂质转运和代谢相关基因变化可能是脾虚痰浊冠状动脉硬化发生的病理机制。
杜莹等研究了脾虚痰浊AS巴马小型猪血清脂蛋白亚类分布的特征并利用PCR Array技术检测主动脉AS信号通路中脂类代谢相关基因表达的变化。9只巴马小型猪随机分为正常组、模型组和治疗组，每组3只，正常组普通饲料喂养，模型组与治疗组给予高热量高脂适量胆盐饲料喂养并进行冠脉球囊挤压伴拉伤及跑步措施进行干预至24周，制备巴马小型猪病症结合脾虚痰浊AS模型，治疗组除上述造模措施外给予健脾祛痰化瘀方喂饲24周。全自动生化分析仪检测血脂水平；Lipoprint脂蛋白分类仪对HDL、LDL颗粒进行分类，分析不同大小HDL、LDL颗粒在脾虚痰浊AS巴马小型猪中的分布特征；PCR Array技术检测脂类代谢相关基因表达。研究发现，与正常组比较，模型组小型猪血清TG、LDL-C水平显著升高；HDL-C水平显著降低；LDL平均颗粒较小，sd-LDL浓度所占百分比显著升高；大颗粒HDL-C含量显著降低、大颗粒HDL-C占HDL-C浓度百分比显著降低、小颗粒HDL-C含量显著升高，小颗粒HDL-C浓度占HDL-C浓度百分比显著升高。与模型组比较，治疗组小型猪LDL-C水平显著降低；大颗粒HDL-C含量显著升高、大颗粒HDL-C百分比显著升高、小颗粒HDL-C含量显著降低，小颗粒HDL-C浓度占HDL-C浓度百分比显著降低。PCR Array技术分析发现模型组小型猪上调≥2倍的基因包括ABCA1、IL4、PTGS1、NR1H3、PPARD，下调＜0.5的基因有LDLR、FABP3、LPL、PPARG。研究认为LDL和HDL亚类分布异常可能是导致AS发生的重要原因之一。
徐跃等利用PCR Array技术开展了脾虚痰浊巴马小型猪冠脉细胞凋亡与细胞生长和增殖相关基因差异性表达的实验研究。实验在建立脾虚痰浊巴马小型猪模型基础上，应用PCR Array技术检测巴马小型猪冠脉细胞增殖与凋亡的相关基因的表达差异性表达。PCR Array显示巴马小型猪冠脉细胞中与细胞凋亡相关基因BAX、BCL2、TGFβ1、TNF、BCL2L1及与细胞生长和增殖相关的基因CSF-2、CCL2、MMP1、MMP3、FGF2均发生差异性变化。研究认为脾虚痰浊巴马小型猪冠脉细胞增殖与凋亡相关基因的变化可能是脾虚痰浊冠状动脉硬化发生的病理机制。
程岩岩等利用PCR Array的技术检测脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌线粒体能量代谢信号通路相关基因mRNA的表达。同王俊岩等实验造模方法，建立脾虚痰浊巴马小型猪模型，检测血脂水平，提取各组巴马小型猪心肌总RNA，应用线粒体能量代谢信号通路PCR芯片测定脾虚痰浊AS巴马小型猪线粒体能量代谢通路相关mRNA表达。PCR Array结果显示模型组与正常组相比，下调的≥4倍基因有17个，占总基因数的20%，如：ATP5A1、ATP5L、ATP5F1、ATP4A、ATP6V1E2等；上调≥4倍的基因转录占基因总数的10%，为OXA1L、NDUFB8、NDUFB9、NDUFS2、NDUFS8，涉及氢离子转运，琥珀酸脱氢酶亚基，NDUF脱氢酶亚基相关基因。该实验研究认为脾虚痰浊AS对心肌线粒体能量代谢的影响可能与涉及氢离子转运，琥珀酸脱氢酶亚基，NDUF脱氢酶亚基相关基因表达改变有关。