从脾论治AS与线粒体能量代谢相关研究
20世纪80年代，刘友章就提出“脾与线粒体相关”，近年来又有研究者认为外界饮食物通过胃的腐熟，小肠的泌别清浊，最终靠脾脏运化将其转化为人体可以利用的水谷精微并输送至全身的过程与现代医学中的线粒体能量代谢过程关系密切。“973”计划项目“脾主运化、统血等脾脏象理论研究”发现脾虚模型大鼠线粒体呼吸链酶复合物活性与ATP水平降低，利用i TRAQ技术对脾虚高脂致AS巴马小型猪心脏线粒体线粒体蛋白组进行分析发现，模型组参与线粒体氧化磷酸化复合体Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的相关蛋白酶表达下调，提示线粒体呼吸链复合物酶表达下降引起的线粒体能量代谢异常可能是脾失健运致AS中医病机的微观体现。
（一）ApoE-/- AS小鼠模型
王莹等围绕四君子汤对高脂诱导ApoE-/-小鼠致AS主动脉线粒体能量代谢的影响开展了实验研究。实验将24只ApoE-/-小鼠随机分为模型组、四君子汤组和辛伐他汀组，8只C57BL/6 Cnc小鼠作为正常组。除正常组给予基础饲料外，其余各组给予高脂饲料。造模12周后，灌胃给药，正常组与模型组给予相应体积的生理盐水，四君子汤组与辛伐他汀组给予相应药物。4周后检测血脂；HE和油红O染色观察主动脉病理及斑块变化情况；透射电镜观察主动脉线粒体超微结构的变化；采用紫外吸收法检测线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶活力的影响；采用Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测线粒体能量代谢相关蛋白Cytc、ATP5a、Ndufs1、Cox5a的表达。Cytc是生物氧化过程中重要的电子传递体，在线粒体嵴上与其他氧化酶排列成呼吸链，参与细胞呼吸过程，Cytc在缺氧时能进入线粒体内，增强氧化磷酸化功能，为机体提供能量。ATP5a是ATP合酶的亚型之一，其位于线粒体内膜上作为呼吸链最后一个部分，负责ATP的合成。Ndufs1（NADH-泛醌氧化还原酶Fe-S蛋白1）是线粒体中电子传递链最大复合物Ⅰ（NADH脱氢酶）的亚基，由核DNA编码，可通过改变线粒体膜电位而产生ATP。Cox5是COX（Cytochrome C oxidase）复合物Ⅳ细胞色素C氧化酶的亚基，位于线粒体电子传递链上的末端酶，在能量代谢过程中起关键作用。以上4个蛋白均在线粒体呼吸链的传递过程中发挥了重要作用，参与ATP的合成，为线粒体能量代谢的稳态提供保障。该研究中发现高脂诱导的ApoE-/-小鼠致AS模型中主动脉呼吸链复合物的活性下降，电镜结果从微观层面观察到AS时主动脉线粒体形状不够规则，膜缺损，嵴模糊或者断裂等，Cytc蛋白表达量升高，ATP5a、Ndufs1、Cox5蛋白表达量下降；使用健脾方四君子汤干预后呼吸链复合物的活性明显回升，同时主动脉电镜结果显示线粒体形状较规则，嵴较完整且未见明显断裂，Cytc蛋白表达量下降，ATP5a、Ndufs1、Cox5蛋白表达量明显升高，说明健脾方-四君子汤可能通过影响线粒体呼吸链复合物的酶活性及线粒体能量代谢相关蛋白的表达而改善线粒体能量代谢，进而达到防治AS的效果，其具体生物学机制还需要进一步研究。
（二）AS家兔模型
陈宁等围绕化瘀祛痰方对AS家兔肝脏线粒体呼吸链酶复合物的影响开展了实验研究。实验将90只健康SPF级雄性新西兰白兔，随机分为正常组、模型组、化瘀祛痰方高、中、低剂量组（4、8、16 g/kg），辛伐他汀组（1.4 mg/kg），每组15只。正常组给予基础饲料喂养，其他组采用高脂饲料喂养，建立AS模型，造模8周后，化瘀祛痰方高、中、低剂量组与辛伐他汀组给予相应药物溶液，正常组和模型组给予等量生理盐水，4周后，检测血脂水平；HE和油红O染色观察肝组织形态学改变；分光光度计法检测家兔肝脏线粒体呼吸链酶复合物活性；Blue-Native-Page技术检测线粒体呼吸链酶复合物含量。脂质代谢异常是形成AS的关键环节，肝脏在脂质代谢中起着核心作用，它是脂肪酸氧化和合成的主要器官。肝脏内脂质合成与分解间的失衡是引起肝与血脂水平的变化的主要原因。有研究表明，减少线粒体氧化磷酸化蛋白含量能够抑制脂肪酸β氧化，从而导致脂肪生成和TG分泌。脂肪酸的合成与分解均需要乙酰辅酶A的参与，线粒体氧化磷酸化的底物是乙酰辅酶A，由此可见乙酰辅酶A是关联着脂肪酸合成分解和线粒体氧化磷酸化的重要桥梁。当线粒体呼吸链上复合体酶的活性或者酶的数量增加则线粒体氧化磷酸化速率提高，加速了肝脏乙酰辅酶A池内得乙酰辅酶A进入线粒体内最终转化为ATP。肝脏内乙酰辅酶A的减少，一方面促使肝脏外更多的脂肪酸进入肝脏内分解成乙酰辅酶A，另一方面使脂肪酸在肝脏内合成胆固醇速率下降，进而由肝脏进入血液的胆固醇也减少。线粒体氧化磷酸化速率的提高加速了循环内脂质进入肝脏内分解成乙酰辅酶A同时也降低了肝脏内乙酰辅酶A转变成胆固醇输出入血，降低了肝脏内和血液中的脂质沉积，说明线粒体呼吸链酶复合物在这一过程中起到了重要的作用。本研究结果显示模型组线粒体呼吸链上酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的活性减弱同时也减少了Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ酶的含量，化瘀祛痰方能纠正以上的变化趋势，进而提高线粒体氧化磷酸化效率。化瘀祛痰方能降低脂质沉积，减缓AS的发展，其作用机制可能是通过调控线粒体呼吸链酶复合物实现的。
郑曲等基于线粒体融合-裂解探讨了化瘀祛痰方对AS家兔心肌纤维化的抑制作用。实验将36只SPF级健康雄性家兔，随机选取6只为正常组，给予普通颗粒饲料；另30只采用高脂饲料建立AS模型。模型复制成功后，随机分为模型组、化瘀祛痰方低、中、高剂量组（4.0、8.0、16.0 g/kg）及辛伐他汀组（1.4 mg/kg），各6只。各给药组按剂量给予相应药物，连续给药4周。检测血清血脂水平，Masson染色观察心肌纤维化程度，免疫组化法检测心肌组织线粒体融合蛋白1（Mitofusin1），线粒体融合蛋白2（Mitofusin2），视神经萎缩蛋白1（Opa1），发动蛋白相关蛋白1（Drp1），分裂蛋白1（Fis1）表达水平。线粒体融合-裂解失衡一般以线粒体融合减少而裂解增多为主要表现，与血管内皮细胞损伤有关，并可进一步参与AS发展。Mitofusin1，Mitofusin2为线粒体外膜蛋白，Opa1为线粒体内膜蛋白，它们分别促进线粒体外膜、内膜的融合；Drp1，Fis1则具有调控线粒体分裂的作用。血管内皮细胞损伤是AS发生的关键，抑制Drp1，Fis1等表达有助于抑制线粒体分裂至结构破碎、减少ROS产生，保护血管内皮细胞，这提示调节线粒体融合-裂解失衡是治疗血管内皮功能障碍相关AS的新思路。而上调Mitofusin1，Mitofusin2及Opa1有助于促进线粒体融合，改善线粒体功能，起到保护作用。该研究采用高脂饲料喂养家兔造模，使得家兔血脂水平升高，心肌间质存在明显的胶原纤维沉积，且呈现条状或网状，排列紊乱，心肌组织CVF明显升高，成功建立了AS伴心肌纤维化模型；采用相应药物治疗后，与模型组比较，各给药组血脂水平均得到明显改善，Masson染色结果也显示心肌纤维化得到不同程度的缓解，其中化瘀祛痰方高剂量组效果最为明显，表明高剂量的化瘀祛痰方能有效调节血脂，消除LDL-C等独立危险因素对于AS的影响，并且可以明显延缓心肌纤维化，防治心血管疾病进展。研究结果还显示，与模型组比较，各给药组家兔心肌组织Mitofusin1，Mitofusin2，Opa1表达水平较高，Drp1，Fis1表达水平较低，且化瘀祛痰方高剂量组变化最为明显，表明化瘀祛痰方能明显上调心肌组织Mitofusin1，Mitofusin2，Opa1表达，促进线粒体融合，下调Drp1，Fis1表达，抑制线粒体裂解，改善线粒体融合-裂解失衡，这可能是化瘀祛痰方抑制减轻AS、延缓心肌纤维化的作用机制之一。
（三）脾虚痰浊AS巴马小型猪模型
中医的脾实际上指的脾系统，主要包括胃、大小肠及胰腺在内的消化系统及“神经-内分泌-免疫”系统，以上系统配合能够调控人体消化吸收、血液生成、能量转化、水液代谢等一系列生理功能以维持体内各系统生理平衡。线粒体则是生物能量物质氧化和转换的主要场所，其内膜上的呼吸链复合物传递电子的过程释放能量，线粒体呼吸链复合物V（ATP合成酶）是一个多亚基蛋白复合体，借由内膜两侧存在的质子动力势在有质子通过时，释放出自由能，驱动ADP和Pi合成ATP。而ATP合成酶数量变化会直接影响机体能量代谢结果。呼吸链的整个过程可以为细胞生存提供95%以上能量，呼吸链酶的异常不仅会直接引发多系统线粒体疾病，还会直接对所在组织的功能造成影响。相关研究已经证明了消化系统尤其是小肠与AS的密切联系，小肠的消化吸收功能失常致使体内脂质代谢障碍，动脉内膜脂糖积聚、出血及血栓形成，进而纤维组织增生及钙质沉着，兼有动脉中层的逐渐蜕变和钙化，最终导致动脉壁增厚变硬、血管腔狭窄等。王佳等围绕健脾化痰祛瘀方对AS巴马猪小肠线粒体呼吸链复合物及ATP活性的影响开展了实验研究。实验中将9只健康半岁雄性广西巴马小型猪，随机分为正常对照组、脾虚痰浊AS组和中药治疗组，每组3只。采用比色法观察各组猪小肠组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ的活性改变情况并测定ATP合成酶数量。结果：与正常对照组相比，脾虚痰浊AS组猪小肠组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性均明显下降，ATP合成酶减少。与脾虚痰浊AS组相比，健脾化痰祛瘀方组猪小肠组织线粒体呼吸链复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ活性均明显回升，ATP合成酶增加。提示健脾化痰祛瘀方可以改善脾虚痰浊AS巴马猪小肠组织线粒体呼吸链复合物活性下降情况，增加ATP合成酶数量。