基因组学与蛋白质组学研究

三、基因组学与蛋白质组学研究

传统中医药与西医在认知方法上存在着巨大差异,组学技术的出现,在两套不同的医学体系间找到连接点,使传统的中医药文化有望变得科学化、规范化,为我国中医药事业的飞速发展,以及其在国内外的推广提供了新的平台,创造了新的机遇。组学技术成为促进中医药发展不可或缺的重要手段。近年来,这些技术在中医证候、中药及针灸等研究方面得到了广泛应用,并取得了重大突破性进展。

(一)基因组学技术

基因组学技术是对基因多样性、基因组表达及功能进行研究的技术,包括碱基序列的组成及改变,DNA甲基化、染色质修饰等,早已广泛应用于中医药研究领域中。目前常用的基因组学技术包括定量分析技术,如实时荧光定量PCR、高通量技术,如全外显子捕获测序技术,以及近来取得新技术突破的单细胞测序技术,三维基因组如Hi-C技术、Micro-C技术,以第三代人工核酸内切酶CRISPR-Cas核酸酶技术为代表的基因修饰技术。基因组学技术可以对上万的基因同时进行检测,具有显著的高通量、整体性、精准性、微观化的优势,是当前实现精准医疗的重要手段,并且随着人类基因组计划的完成以及高通量测序技术的飞速发展,基因组学技术日趋成熟,使其在医药科研和临床研究中得到广泛应用,更为中医证候、针灸及中药研究发展创造,提供了新的发展机遇。

虽然基因组学有相比于其他组学不可代替的优势,然而不可否认两种及更多组学方法联合使用是阐明药物反应、生物学途径和新型生物标志物的有力工具,可以弥补一种技术的缺陷。在今后的研究中可以联合基因组学、转录组学、代谢组学、蛋白质组学等多组学方法,完善不同组织中的基因转录前后标志物的差异特征、健全和丰富数据库,一方面相互整合印证,互相补充;另一方面多维度、全面理解生物不同阶段的生命过程及机制网络,研究能够适用于中医理论规律的大数据算法,建立一套更加完整的中医药生物信息分析体系。“证候组学”提出就是一个很好的方向,要求考虑证候不同要素、各种影响因素(心理、社会、环境等)进行建模,从而揭示复杂疾病的动态属性,包括证候的辨别、证候和相关的分子靶点识别、网状结构系统的构建与分析,最终达到最有效治疗,为从证候的诊断到中药处方的精准化和个体化提供了渠道。

(二)蛋白质组学技术

蛋白质组(Proteome)的概念是由澳大利亚学者Wilkins和Williams于1994年首次提出,指在一种细胞、组织或生物体中的完整基因组所表达的全套蛋白质。蛋白质组学(Proteomics)是蛋白质组概念的延伸,指以蛋白质组为研究对象,从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质的组成与活动规律。蛋白质组学从不同角度有不同的分类方式。从研究内容上可以分为表达蛋白质组学、结构蛋白质组学和差异蛋白质组学;从研究策略上可分为经典蛋白质组学(基于凝胶电泳-质谱技术)和鸟枪法蛋白质组学(基于二维液相色谱-串联质谱技术);从质谱鉴定方法上可以分为自下而上(Bottom-up,BU)的蛋白质组学和自上而下(Top-down,TD)的蛋白质组学等。

应用蛋白质组学的方法,可以通过比较分析细胞或动物模型给药前后蛋白质表达谱的差异,找到中药的作用靶点和相关通路,进而阐明中药的分子作用机制。该方法已被广泛应用于中药复方、单味中药和中药单体化合物作用机制的研究中,且相关研究呈现递增趋势。蛋白质组学技术可分两大类:

1.蛋白质组的分离技术

双向凝胶电泳(Two-dimensional electrophoresis,2-DE),该技术是基于蛋白质的分离,其原理是根据不同蛋白质的等电点和相对分子质量的差异使之在二相平面上分开。双向凝胶电泳是一种经典的蛋白质分离方法,但由于其存在重复性差,人为误差大等问题,通用(GE)公司在双向凝胶电泳基础上开发出荧光差异凝胶电泳(differential in gel electrophoresis,DIGE),该技术在分析中引入了内参。

多维液相色谱(Multidimensional liquid chromatography,MDLC),该技术是基于肽(先将蛋白质酶解成多肽)的分离,是指2种或2种以上具有不同原理特性的液相分离方法的优化和组合,是目前最常用也最有发展前景的分离技术。多维液相色谱分离技术主要包括离子交换色谱-反相液相色谱、反相液相色谱-反相液相色谱和亲水色谱-反相液相色谱等。该技术的优势是对蛋白质组进行分析时大大降低了歧视效应,并可直接与质谱联用,便于自动化,易于实现高通量,提高了检测的动态范围和灵敏度,因此在蛋白质组学的研究中已逐步取代双向凝胶电泳成为蛋白质分离技术的主流。

除此之外,蛋白质分离常用的技术还有细胞分级分离技术、层析分离技术和非凝胶技术等,其中双向凝胶电泳技术具有较高的灵敏度和分辨率,是目前最有效的分离技术,也是蛋白质组技术的核心,可分离细胞内提取的复杂蛋白质混合物。

2.蛋白质组的鉴定技术

常用的技术有质谱技术、蛋白质芯片技术、噬菌体显示技术和大规模双交技术等,其中质谱技术以其快速、准确、灵敏而成为蛋白质组最重要的鉴定技术,可对经过双向电泳分离的目标蛋白质进行鉴定与分析。其基本原理是将蛋白质样品先经过离子化,再根据不同离子间质荷比(m/z)的差异来分离并确定相对分子质量。质谱仪主要由离子源、质量分析器和检测器部分组成。目前大致可以归纳为两类:中医药对某一已知蛋白表达调整作用的研究;中医药对若干已知或未知蛋白表达水平的调整作用。蛋白质组学技术能通过对用药前后组织或细胞的差异蛋白质组展示来评价中药的药效,而且还可以针对其中特异表达或差异表达显著的蛋白点进行更深一步的后续质谱鉴定研究,确定药物作用的靶蛋白。

中医药对机体功能状态的节过程,涉及分子、细胞、组织、器官、整体多个层面,对多层面的系统关联性研究正是基因组学和蛋白质组学研究的主要内容。中医认为疾病的发生主要是人体整体功能的失调,证候是疾病发展过程某阶段的病机概括,是机体内因和环境外因综合作用的机体反应状态,并随着病程的发展而发生相应变化。证候既然是有规律的病理表现,可反应在基因组水平上,通过对疾病的中医证候基因组学特征的研究,探索疾病、证候、基因组学之间的关系。从同一疾病不同证候和同一证候不同疾病的基因表达谱差异比较中寻找证候的共同性和差异性,建立一个“证候基因表达谱”,从而揭示中医证候的科学内涵,并为其客观化诊断提供依据和方法。

另外,基因组学、蛋白质组学技术也已广泛应用于天然动植物中药,包括稀有物种名贵物种的保护、鉴别、优化等。如在中药资源方面,大多中药材中有效成分往往含量甚微,可通过功能基因组和蛋白质组研究,对生物体中影响有效或毒性成分合成的关键基因进行调控,促进其表达,提高目标产物的产量,降低毒性成分和非有效成分含量,甚而实现单独生产有效成分等。