细胞和亚细胞组分分析

二、细胞和亚细胞组分分析

细胞和亚细胞组分的分析主要利用细胞化学技术分析。细胞化学技术是在保持组织、细胞原有生活结构状态及化学成分的基础上利用物理学、化学、免疫学、分子生物学等原理与技术手段,对组织与细胞内的化学成分及其变化规律进行定性、定位、定量研究的技术。除了对组织进行研究外,对体外培养细胞、腹腔液细胞、血细胞等独立存在的细胞也可以进行研究分析。常用技术包括普通细胞化学技术、酶细胞化学技术、免疫细胞化学技术、放射自显影技术、荧光细胞化学技术、电镜细胞化学技术等。检测仪器除了光学显微镜、荧光显微镜、电子显微镜外,还可使用显微分光光度计、图像分析仪、流式细胞仪及激光共聚焦显微镜等。

在中医药研究中,利用细胞化学技术可以检测人、动物等有机体的不同发育阶段、不同组织部位及异常生理、病理状态下组织细胞内结构或功能成分的表达及变化特点,从而研究个体发育过程中细胞增殖与分化,遗传与发生机制以及疾病的病因,病理诊断及中医药干预效应及其作用机制等。如可用普通细胞化学技术观察分析中医药对细胞糖类、脂类、蛋白质、核酸等在细胞中的分布和含量的影响作用用酶细胞化学技术观察分析中医药对细胞酶在细胞内的分布及酶活性强弱的影响;免疫组织化学技术可以确定组织细胞内及膜表面多肽和蛋白质进行定位、定性及定量的研究,从而评价中医药对其表达的调控作用等。如用细胞化学技术观察了中药“四君子汤加味”对“脾气虚”症和因“脾气虚”形成癌变的生理病理变化,为中药治疗“脾气虚”症和治疗癌症提供了新的思路和靶点。

1.免疫组织化学技术

免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)简称免疫组化,或称免疫细胞化学(Immunocytochemistry,ICC)。IHC属于免疫标记技术,用标记的特异性抗体(或抗原)对组织内抗原(或抗体)或其他物质进行原位显示,在光镜或电镜下观察与分析。

(1)免疫荧光细胞化学技术:免疫荧光细胞化学技术的原理是将已知的抗体或抗原分子标记上荧光素,当与其相对应的抗原或抗体起反应时,在形成的复合物上就带有一定量的荧光素,在荧光显微镜下观察发出荧光的抗原抗体结合部位,检测出抗原或抗体。常用的荧光素有异硫氰酸荧光素(Fluorescein isothiocyanate,FITC)、四甲基异氰酸罗达明(Tetramethylrhodamine isothiocyanate,TMRITC)、四乙基罗达明(Lissamine rhodamineB200,RB200)等,最常用的是FITC和TMRITC。FITC为黄色粉末,最大激发波长为490nm,最大发射波长为520nm,呈明显的黄绿色荧光。TMRITC为紫红色粉末,易溶于水,最大激发波长为580nm,最大发射波长为610nm,为橙红色荧光。

(2)免疫酶细胞化学技术:分为酶标记抗体法(酶标法)和非标记抗体酶法。酶标记抗体技术是通过共价键将酶连接在抗体上,制成酶标抗体,再借酶对底物的特异催化作用,生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒,在光镜或电镜下进行细胞表面及细胞内各种抗原成分的定位。标记抗体常用的酶有辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等。非标记抗体酶法是用免疫方法制备抗体,并且产生酶抗体的动物必须与制备待测抗原相应抗体的动物是同种族。当这种动物的免疫球蛋白作为抗原免疫另一种动物时得到的抗体,就能像桥梁一样与检测抗原的抗体和抗酶抗体连接在一起,酶再与抗酶抗体相结合,通过酶的显色达到对抗原的显示

(3)亲和免疫细胞化学技术:亲和物质为具有多价结合能力的物质,包括生物素、亲和素和葡萄球菌A蛋白(StaphylococcalproteinA,SPA)等。亲和物质之间不仅具有高度亲和力,而且可与酶、荧光素、同位素和铁蛋白等结合。免疫细胞化学与细胞生物学及生物化学紧密结合,将亲和物质引入免疫细胞化学中,形成亲和免疫细胞化学技术。

2.流式细胞术

流式细胞术(Flow cytometry,FCM)是20世纪70年代初发展起来的一项高新技术,它最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下,通过荧光探针的协助,从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选。与传统的荧光镜检查相比,具有快速、大量、准确、灵敏、定量等优点,成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞仪就是进行流式细胞分析的仪器,是在单个细胞分析和分选基础上发展起来的对细胞的物理或化学性质(如大小、内部结构、DNA、RNA、蛋白质、抗原等)进行快速测量并可分类收集的高技术。它集激光技术、流体力学、计算机技术、细胞化学、细胞免疫学等多种学科于一体,是一种非常先进的检测仪器,被誉为实验室的“CT”。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原,细胞内DNA、RNA含量等。流式细胞术已广泛应用于血液学、免疫学、生物化学、药物学、肿瘤学以及分子生物学等方面的研究和临床常规工作。流式细胞术(Flowcytometry)是利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的生物学特征(体积、颗粒度、细胞表面/胞浆/核内抗原等)以及根据这些生物学特征精确分选细胞的技术,主要包括流式分析和流式分选两部分。

随着对流式细胞术研究的日益深入,流式细胞术已经在基础和临床研究中得到了广泛的应用。流式细胞术在基础研究中可用于淋巴细胞功能、树突状细胞研究、造血干细胞研究、细胞周期分析、细胞凋亡分析、凋亡相关蛋白分析、细胞功能研究、多药耐药基因研究、肿瘤相关基因表达研究、RNA测定、DNA测定、总蛋白测定、癌基因和抑癌基因表达产物测定、血管内皮细胞研究:在临床研究中用于淋巴细胞亚群测定、血小板分析、网织红细胞分析、白血病和淋巴瘤免疫分型、HLA-B27分析、阵发性睡眠性血红蛋白尿(PNH)诊断、人类同种异体器官移植中应用、细胞因子测定、AIDS诊断与治疗和疗效评价和flow-FISH法测定端粒长度等。

(1)细胞生物学:细胞凋亡研究:定量分析细胞周期并分选不同细胞周期时相的细胞;分析生物大分子如DNA、RNA、抗原、癌基因表达产物等物质与细胞增殖周期的关系;进行染色体核型分析,并可纯化X或Y染色体。

(2)肿瘤学:这是流式细胞术在临床医学中应用最早的一个领域。DNA倍体含量测定是鉴别良、恶性肿瘤的特异指标。近年来已应用DNA倍体测定技术,对白血病、淋巴瘤及肺癌、膀胱癌、前列腺癌等多种实体瘤细胞进行探测,用单克隆抗体技术清除血液中的肿瘤细胞。

(3)免疫学:流式细胞术通过荧光抗原抗体检测技术对细胞表面抗原分析,进行细胞分类和亚群分析。这一技术对于人体细胞免疫功能的评估以及各种血液病及肿瘤的诊断和治疗有重要作用。研究细胞周期或DA倍体与细胞表面受体及抗原表达的关系;进行免疫活性细胞的分型与纯化;分析淋巴细胞亚群与疾病的关系;免疫缺陷病如艾滋病的诊断;器官移植后的免疫学监测等。

(4)血液学:血液细胞的分类、分型,造血细胞分化的研究,血细胞中各种酶的定量分析,如过氧化物酶、非特异性酯酶等;用NBT及DNA双染色法可研究白血病细胞分化成熟与细胞增殖周期变化的关系,检测母体血液中Rh(+)或抗D抗原阳性细胞,以了解胎儿是否可能因Rh血型不合而发生严重溶血;检测血液中循环免疫复合物可以诊断自身免疫性疾病,如红斑狼疮等;测定血小板膜糖蛋白的表达情况,检查血小板功能;测量网织红细胞的成熟度,判断红细胞增殖能力;网织红细胞计数,反映骨髓造血功能。

(5)药物学:检测药物在细胞中的分布,研究药物的作用机制,亦可用于筛选新药,如化疗药物对肿瘤的凋亡机制,可通过测DNA凋亡峰,Bcl-2凋亡调节蛋白等。