蛋白质组学研究

蛋白质组学概念由澳大利亚科学家Wilkins等率先提出，其目的是通过各种技术手段对蛋白质在生物体内的表达进行多层次评估，从而更加熟悉复杂的生理病理过程。根据蛋白质组学研究技术的原理，可以分为化学蛋白质组学、差异蛋白质组学和定量蛋白质组学；从研究策略的角度来看，可以将其分为经典蛋白质组学策略（基于双向凝胶电泳-质谱技术）和鸟枪法蛋白质组学策略（基于二维液相色谱-串联质谱技术）。科技在医学领域的迅猛发展，现代生物学技术已经深入到后基因组-功能基因组的研究，而蛋白质组学是功能基因组研究的一个重要技术支撑体系。蛋白质组为生物机体、组织、细胞在特定的时间和空间表达的所有蛋白质。蛋白质组学可以从整体水平上反映特定状态下蛋白质表达的动态演变过程，其特点是采用高通量、高分辨率的蛋白鉴定技术，全景式的研究在特定生理、病理、药理条件下的蛋白表达及功能谱，其从整体上研究蛋白质的表达和功能的方法与中医基础理论中的整体观念不谋而合。

目前，蛋白组学技术已被初步应用于证候本质的研究领域，蛋白质组学研究已涉及中医脾虚证、血虚证、肾阳虚、肾阴虚、肝郁证、毒热血瘀证、气滞血瘀证、肝阳上亢证等。胡学军研究脾虚小鼠小肠上皮细胞的蛋白质组特征，对33个蛋白质点表达量的分析结果表明，蛋白质表达呈双向变化，以下调为主，模型组与正常组相比表达下调蛋白质点27个，表达变化的蛋白质涉及细胞各部位。卢德照对肾阳虚大鼠肝线粒体蛋白质组研究发现，肾阳虚动物能量代谢相关酶的变化与肾阳虚的临床虚寒症状有关。赵慧辉探讨冠心病血瘀证蛋白质组学特点发现患者血浆α1-酸性糖蛋白、结合珠蛋白α1链等表达升高，载脂蛋白AⅠ、载脂蛋白AⅣ等表达降低，提出该差异蛋白可能作为冠心病血瘀证诊断或治疗的新靶点。丁莺总结目前蛋白质组学技术在消化系统肿瘤中的应用，发现食管癌、胃癌、肝癌等消化系统癌症患者的组织提取物均有多种蛋白质表达的显著变化，这些结果可能成为此类癌症的诊断标志物和潜在的分子治疗靶标。

1.基于双向电泳的蛋白质组学分析

双向电泳（Two-dimensionalg elelectrophoresis，2-DE）是一种分析从细胞、组织或其他生物样本中提取的蛋白质混合物的有力手段，是目前唯一能将数千种蛋白质同时分离与展示的分离技术，其高分辨率、高重复性和兼具微量制备的性能是其他分离方法所无与伦比的。双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术被称为蛋白质组学研究的三大基本支撑技术。双向电泳的基本原理是先将蛋白质根据其等电点在pH梯度胶内（载体两性电解质pH梯度或固相pH梯度）进行等电聚焦，即按照它们等电点的不同进行分离。然后按照它们的相对分子质量大小进行SDS-PAGE第二次电泳分离。样品中的蛋白质经过等电点和相对分子质量的两次分离后，可以得到分子的等电点、相对分子质量和表达量等信息。值得注意的是，双向电泳分离的结果是蛋白质点而不是条带。根据Cartesin坐标系统，从左到右是pH的增加，从下到上是相对分子质量的增加。双向电泳实验的基本流程包括：蛋白质提取、等电点聚焦、SDS-PAGE分离、差异蛋白质筛选（包括手动和图像软件处理）、差异蛋白质鉴定（质谱技术）。

2.基于质谱技术的蛋白质组学分析

质谱（Masss petrometry）是带电原子、分子或分子碎片按质荷比（或质量）的大小顺序排列的图谱。质谱仪是一类能使物质粒子高化成离子并通过适当的电场、磁场将它们按空间位置、时间先后或者轨道稳定与否实现质荷比分离，并检测强度后进行物质分析的仪器。质谱仪主要由分析系统、电学系统和真空系统组成。质谱技术自诞生以来，一直是有机小分子结构分析的重要工具之一，而20世纪80年代末，Karas和Fenn等先后发明了基质辅助激光电离和电喷雾电离技术，更是启动了质谱在生物领域中的应用。现在已有能满足不同需要的，广泛应用于各个研究领域的质谱仪可供使用。如傅里叶回旋共振质谱仪（FTMS）、基质辅助激光电离-飞行时间质谱仪（MALDI-TOF/MS）、电喷雾-四极-飞行时间质谱仪（Q-TOF/MS）、基质辅助激光电离-离子阱质谱仪（MALDI-iontrap MS）等。质谱技术在蛋白质组学中发挥着重要作用。首先经双向电泳分离的蛋白质的鉴定必须借助质谱技术来完成（如通过MALDI-TOF/MS或LC-MS/MS技术）。其次，质谱技术还广泛应用于定量蛋白质组学，如基于同位素标记的iTRAQ技术可以同时对8个样本进行标记、检测和定量分析。

3.与蛋白质组学直接相关的糖组学研究

糖组学是研究糖组结构与功能的科学，主要是对聚糖与蛋白质间的相互作用和功能进行全面研究。蛋白质表达之中或之后的修饰对蛋白质表达及功能的影响很大。蛋白质修饰包括甲基化、磷酸化、乙酰化及糖基化等。据Apweiler等的研究指出，真核生物中约有一半以上的天然蛋白质都是糖蛋白，因此，糖基化修饰是蛋白质修饰的主要方式之一。糖基化蛋白质因糖组分的不同和糖基化的多样性而导致蛋白质在结构和功能等方面都显著不同。所以，蛋白质组学除了要完成对全部蛋白质的鉴定外，还要深入研究糖组学，只有这样，才能比较全面地理解蛋白质的结构和功能。糖组学的研究方法目前已较为成熟，常见的技术包括双向电泳分离糖蛋白经质谱技术鉴定、聚糖分子的微阵列技术及基于转基因技术研究聚糖分子等实验方法。其中，经双向电泳分离糖蛋白并进行后续分析是糖蛋白研究的经典方法。通过如前文所述的双向电泳方法对总蛋白质进行分离，然后用糖基化蛋白染色液进行染色显色。常用的糖基化蛋白染色试剂通常是以凝集素、夹心抗体或生物素等为基础的染色试剂。将染色的糖基化经胰蛋白酶酶切后利用质谱技术对糖肽和糖链进行鉴定、分析，并通过综合组谱最终揭示糖蛋白的糖组分及糖基化位点等内容。