从脾论治AS与凋亡机制相关研究

（一）体内实验研究

程岩岩等围绕健脾化痰祛瘀方对AS巴马小型猪心肌细胞氧化应激及凋亡的影响开展了实验研究。实验将健康巴马小型猪15只，月龄6～8个月，随机分为正常对照组、模型组、中药治疗组3组，每组5只。正常对照组予基础饲料喂饲，模型组、中药治疗组采用高脂高热量喂养。高脂喂饲24周后健脾化痰祛瘀组予健脾化痰祛瘀方药搅拌于饲料中喂食。检测各组巴马小型猪的心肌ROS、CAT、MDA、GSH-PX的含量；Western Blot检测各组巴马小型猪心肌细胞Bax、Bcl-2、Cyto C、Caspase-3的含量。实验发现，模型组巴马小型猪心肌Bax表达明显升高，而Bcl-2表达明显降低，Cyto C、Caspase-3在心肌表达明显增加，说明脾虚痰浊AS可以降低Bcl-2/Bax的比值从而诱导细胞色素C从线粒体中的释放，激活Caspase-3，诱导心肌细胞的凋亡。而健脾化痰祛瘀方治疗的脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌细胞Bax表达明显减低，而Bcl-2表达明显升高，Cyto C表达显著减低，Caspase-3在心肌表达明显减少，说明健脾化痰祛瘀法可以提高Bcl-2/Bax的比值从而抑制细胞色素C从线粒体中的释放，抑制Caspase-3的生成，抑制心肌细胞的凋亡。脾虚痰浊AS巴马小型猪心肌线粒体产生过多的氧自由基，氧自由基损伤可以使心肌组织的抗氧化系统失衡，过量的氧自由基作用于线粒体破坏线粒体的内膜，破坏其功能，产生了氧化反应，破坏正常的心肌组织。健脾化痰祛瘀方可以从根本上改善心肌线粒体的氧化应激反应，促进抑制凋亡和调控凋亡因子的释放，减少心肌凋亡。

LncRNA是一类长度超过200 nt的功能性RNA分子，不具有蛋白编码功能，早期被认为是RNA转录过程中的“噪声”。LncRNA在心血管疾病中存在差异表达，并且通过不同的作用机制在心血管疾病的调控网络中发挥作用，参与心血管疾病的发生发展。miRNA通过与靶mRNA上的互补序列结合来抑制mRNA的翻译或促进mRNA的降解，而LncRNA可以作为miRNA海绵与miRNA相互作用影响mRNA进而调控基因表达。TUG1是一种进化上高度保守的长链非编码RNA，LncRNA TUG1与miR-138-5p相互影响可能参与慢性心力衰竭的发病发展，并且可通过上调miR-26a缓解LPS诱导的线粒体损伤、细胞凋亡。miRNA-26在心血管疾病中发挥重要作用，其在心脏疾病中表达下调，miRNA-26在心肌肥大中起关键作用，大鼠模型和心肌细胞中miRNA-26a/b表达均下调。线粒体凋亡途径在AS发生发展过程中发挥着重要的作用，并且在此过程中，GPs具有调节作用。宋囡等围绕绞股蓝皂苷（GPs）调控长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡对ApoE-/-AS小鼠肝脏脂质沉积的影响及机制开展了实验研究。实验将10只C57BL/6J小鼠作为正常对照组，20只健康ApoE-/-小鼠随机分为模型组、绞股蓝皂苷组（高脂饲料喂养12周），灌胃给药4周。HE染色观察小鼠肝脏脂质沉积情况，全自动生化分析仪检测血脂水平，实时荧光定量Q-PCR检测长链非编码TUG1、miRNA-26a表达，实时荧光定量Q-PCR及Wes全自动蛋白质印迹定量分析系统检测Bcl2、Bax、Cytc、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、cleaved PARP基因及蛋白表达。研究发现GPs可以改善ApoE-/-AS小鼠血脂水平及肝脏脂质沉积情况。在此基础上，首先发现ApoE-/-AS小鼠肝脏长链非编码RNA TUG1明显上调，而miR-26a显著下调，经GPs干预后，上述情况出现反向结果。而线粒体凋亡途径相关指标也同时发生变化，ApoE-/-AS小鼠肝脏Bcl2、Bax、Cytc、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表达趋势基本一致，在模型组中Bcl2 mRNA及蛋白表达显著下调，Bax、Cytc、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表达出现上调，GPs干预后，Bcl2 mRNA及蛋白表达有所上调，Bax、Cytc、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9及cleaved PARP mRNA及蛋白表达有所下调。线粒体是细胞有氧呼吸的主要基地和供应能量的重要场所，在细胞凋亡的发生中发挥着重要的作用。线粒体是细胞凋亡的关键调节器，作为细胞的能量工厂，参与氧化磷酸化和ATP的生成，同时线粒体功能障碍也将会导致ATP合成受损。内源性线粒体途径是细胞凋亡主要途径之一，Cytc是线粒体内包含的与细胞凋亡存在密切关系的物质。在凋亡信号的刺激下，线粒体膜的通透性处于开发状态，Cytc的释放以及caspase的激活进而发生线粒体凋亡。可见，Cytc由线粒体释放至胞浆是引发线粒体凋亡途径发生的关键步骤，Cytc释放是在细胞凋亡早期发生的重要事件，具体环节为通过线粒体MPTP或Bcl-2家族成员调控的MOMP释放到细胞质中，接下来释放到细胞质中的Cytc进一步被利用，可在ATP/dATP存在的情况下，与Caspase-9结合形成凋亡复合物，继而活化Caspase-9，活化后的Caspase-9又可激活Caspase-3，进一步启动Caspase级联反应而导致细胞凋亡。Caspase是一类酶原，正常状态下是以无活性的结构存在的，Caspase依赖的线粒体通路中，Cytc从线粒体释放后与ATP，Apaf-1联合构成多聚体，同时Caspase-9和它结合构成凋亡体，可水解Caspase-9酶原而激活Caspase-9，激活的Caspase-9又可以进一步激活Caspase-3，活化的Caspase-3可切割DNA修复酶PARP，使PARP被剪切为小片段，不能发挥其正常功能，进而导致DNA裂解，最终引起细胞凋亡。综上结果说明，GPs可能通过影响长链非编码RNA TUG1/miR-26a干扰线粒体凋亡改善ApoE-/- AS小鼠肝脏脂质沉积，进而防治AS，其干扰机制可能与调控线粒体凋亡的Bcl2、Bax、Cytc、cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9及cleaved PARP表达水平有关。

（二）体外实验

内皮细胞损伤在心血管疾病的发生发展中起着重要的作用，是现代心血管疾病研究的热点。贾连群等以体外培养人脐静脉内皮细胞作为实验对象，利用H2O2诱导内皮细胞凋亡进而探讨化瘀祛痰方药全方及其拆方保护内皮细胞，抗AS作用的分子机制。实验将40只SD大鼠随机分为5组，即全方组、补气组、化瘀组、祛痰组、空白血清对照组。各组大鼠分别以相应中药煎剂或生理盐水连续灌胃9d，末次灌胃给药2小时后，腹主动脉采血，离心后分离血清。体外培养EA.hy926细胞，随机分为7组，即①正常对照组。②H2O2刺激组。③全方组。④补气组。⑤化瘀组。⑥祛痰组。⑦空白血清对照组。其中②组加入终浓度为300μmol/L H2O2③～⑦组用各组含药血清（浓度为10%）预处理24小时后加入终浓度为300μmol/L H2O2，各组细胞培养24小时后进行各项指标测定。采用流式细胞术检测EA.hy926细胞凋亡；Real-time PCR定量分析bcl-2、bax、Caspase-3 mRNA表达；比色法检测Caspase-3活性；Western-blot检测bcl-2、bax蛋白表达。氧化应激损伤可导致内皮细胞活力显著降低，凋亡发生率显著增高。凋亡又称程序性死亡，发生的原因和途径是复杂多样的，许多基因参与细胞凋亡的基因调控。bcl-2作为抗细胞凋亡基因可通过抑制细胞色素C的释放，增强内皮细胞的抗氧化作用，进而抑制内皮细胞凋亡。Bax是促细胞凋亡基因的代表，通过与bcl-2基因互相拮抗，从而调节细胞凋亡的发生、发展。Caspase家族是一组半胱氨酸蛋白酶，是细胞凋亡的执行者，具有促进细胞蛋白溶解系统活化作用。其中Caspase-3是凋亡的关键执行分子，大多数触发细胞凋亡的因素，最终均需要通过Caspase-3介导的信号传递途径导致细胞凋亡。该研究结果显示，H2O2刺激后EA.hy926细胞凋亡率显著升高，bax、Caspase-3表达显著增加，而bcl-2表达显著减少。化瘀祛痰方药全方含药血清干预作用强于各拆方组，表现为细胞凋亡率显著降低，bax、Caspase-3表达显著减少，而bcl-2表达显著增加，提示化瘀祛痰方药全方可以通过保护内皮细胞免受氧化应激损伤，调节凋亡相关基因表达，发挥抑制内皮细胞凋亡的作用。