三、内质网应激
蛋白质是生命的物质基础，也是生物活动的主要承担者。蛋白质稳态需要新合成蛋白质的有效折叠以及蛋白质质量的控制和降解。真核细胞的膜蛋白及分泌性蛋白是在内质网（endoplasmic reticulum，ER）中合成后，经过翻译后修饰、折叠和组装，由高尔基体进一步加工后转运到膜上或分泌到胞外。内质网肩负着维持蛋白质稳态的使命，在生理条件下，内质网腔内分子伴侣帮助新合成的天然蛋白质的正确折叠，质量控制系统识别错误折叠的蛋白质，通过蛋白酶体、溶酶体和自噬途径降解错误折叠蛋白质。许多病理生理状态和细胞环境改变会诱发内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS），包括蛋白质合成水平的提高、泛素化和蛋白酶体降解受损、自噬不足、能量不足、营养过剩或营养不足、钙水平失调或氧化还原稳态失衡、炎症反应和缺氧。大量研究表明，在蛋白质错误折叠相关疾病中可以检测到ERS，但ERS在蛋白质错误折叠相关疾病的病理生理过程发挥的具体作用尚不完全清楚。因此，深入研究ERS与蛋白质错误折叠相关疾病的关系已成为分子生物学新的研究前沿。
1.ERS与未折叠蛋白质反应·内质网是蛋白质合成的主要场所，其腔内存在帮助分泌蛋白和膜蛋白完成折叠和翻译后修饰的分子伴侣家族、辅酶和辅助因子，它们帮助蛋白质形成正确的天然构象。内质网腔中新合成的蛋白质是否能从内质网中释放主要受到多种内质网滞留信号与内质网退出信号的监测。含有发育良好内质网的细胞具有较高的蛋白质合成潜力。相对地，合成蛋白质较少的细胞则会为了节省资源限制内质网的发育。那么无论其大小如何，细胞都在内质网分泌能力的极限附近运作，只有正确折叠的蛋白质才能运输到高尔基体，并能够作为分泌蛋白或膜蛋白发挥作用。错误折叠的蛋白质保留在内质网内并发生内质网相关降解（endoplasmic reticulum associated degradation，ERAD）。为了确保蛋白质的折叠能力与需求平衡，细胞不断监测内质网腔中错误折叠的蛋白质的量并启动校正反应。当内质网中错误折叠的蛋白质累积超过临界阈值时，内质网平衡遭到破坏，细胞将启动未折叠蛋白反应（unfolded protein response，UPR），UPR协调细胞的转录和翻译变化，上调分子伴侣的表达来参与折叠和稳定内质网腔内的蛋白质，通过ERAD降解错误折叠的蛋白质和受调节的IRE1依赖性mRNA衰减（regulated IRE1-dependent decay of mRNA，RIDD）降低mRNA浓度，恢复蛋白质稳态。如果内质网腔内错误折叠蛋白质积累过多，细胞不能恢复蛋白质稳态，UPR会抑制适应性反应，引发细胞凋亡。UPR由3种内质网跨膜蛋白启动：跨膜蛋白肌醇需酶1（inositol-requiring enzyme 1，IRE1）、活化转录因子6（activating transcription factor 6，ATF6）和双链RNA依赖的蛋白激酶样内质网激酶（PKR-like ER kinase，PERK）。
2.ERS与细胞凋亡·若损伤严重，UPR不能减少ERS，内环境稳态不能及时恢复，信号则由促生存向促凋亡转换，引起细胞凋亡。凋亡受C/EBP同源蛋白（C/EBP homologous protein，CHOP）、半胱天冬氨酸蛋白酶-12（cysteme aspartate specific protease，Caspase-12）和IRE1的调节。
CHOP是一种控制凋亡通路相关基因的转录因子，也被称为GADD153。在非应激状态下，CHOP的表达水平很低，ERS发生时，CHOP表达水平大幅增加。研究显示，CHOP表达水平增加可抑制B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）蛋白家族中的抗凋亡成员Bcl-2样蛋白表达，上调促凋亡成员BH3的表达；调节促凋亡蛋白BAX-BAK同源二聚化，使线粒体外膜渗透性增加，导致细胞色素C的释放，引发凋亡级联反应。CHOP可直接调控TNF家族成员细胞表面死亡受体5（death receptor 5，DR5）的转录，触发凋亡蛋白酶8（caspase8）诱导的凋亡。PERK诱导的CHOP表达直接上调生长停滞及DNA损伤诱导34（GADD34）的转录，形成辅因子蛋白磷酸酶1复合物，促进磷酸化的eIF2α脱磷酸以及蛋白质翻译。若不能恢复内质网稳态，GAD34的上调则进一步促进错误折叠蛋白聚集和活性氧（ROS）的生成，最终引发凋亡。对CHOP诱导的凋亡机制尚不是很清楚，但有证据表明，CHOP与许多人类疾病有关，包括糖尿病、神经变性疾病、缺血性疾病和肿瘤等。
凋亡蛋白酶（caspase）又称半胱天冬酶，对底物天冬氨酸部位有特异水解作用，其活性中心富含半胱氨酸的蛋白酶。根据caspases在凋亡信号通路中的位置分为启动性和效应性凋亡蛋白酶，其中启动性凋亡蛋白酶包括caspase8、9、12，效应性caspases包括caspase3、6和7。在caspase活化级联中，效应性caspases起重要作用，它可以迅速导致细胞凋亡。正常情况下，caspase以无活性的酶原或前体（pro-caspase）的形式存在，活化后可水解底物，通过级联反应诱发凋亡。pro-caspase12位于内质网膜，可以单独存在或与肿瘤坏死因子受体关联因子2（TRAF2）形成复合物。当受到持续刺激时，通过2条途径诱发细胞凋亡。第一，单独存在的pro-caspase12转移至细胞质，被激活成具有活性的caspase12，进一步激活下游的caspase9、3促使细胞凋亡。第二，TRAF2-pro-caspase12复合物解离，TRAF与IRE1、c-Jun N端激酶（JNK）形成IRE-JNK-TRAF2复合物，后者能够激活凋亡信号调节酶1（ASK1），ASK1使JNK发生磷酸化，引发细胞凋亡。
IRE1扮演着跨膜激酶和内切核糖核酸酶双重角色参与mRNA剪接来传递UPR信号。IRE1既能够启动URP促进细胞存活，也能以IRE1-JNK-TRAF2复合物的形式引起细胞凋亡。磷酸化的JNK通过多种途径诱导凋亡信号。JNK异位至线粒体膜，通过磷酸化和抑制Bcl-2蛋白促进细胞凋亡。JNK还促使Bcl-2相关X蛋白（BaX）和Bcl-2相关死亡启动子（BaD）促凋亡蛋白定位于线粒体，破坏线粒体膜，释放细胞色素C，激活caspase9和3，引起细胞凋亡。活化的JNK与线粒体外膜上的SH3同源BTK结合蛋白（Sab）结合，使线粒体产生ROS，诱导细胞凋亡。IRE1α/TRAF2结合物通过caspase12促凋亡信号通路激活凋亡。受体相互作用丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（RIPK1）通过线粒体膜上的TNF受体1刺激IRE1α介导的JNK激活，RIPK1和IRE1α结合激活caspase8，然后继续激活caspase9、3介导细胞损伤。IRE1α/TRAF2/ASK1激活核转录因子κB（NF-κB）信号途径。此外，URP过程中产生的XBP1s还能增强CHOP介导的细胞凋亡。
ERS既是细胞抵抗应激的重要机制，也是应激损伤细胞的重要机制。一定程度的ERS因能激活保护机制如分子伴侣表达而有细胞保护作用，该反应能力低下则可能增加细胞对刺激损伤的敏感性，相反，应激过强时，保护机制不能与损伤抗衡，ERS可通过caspase12独立地导致细胞凋亡。
3.ERS在疾病中的作用·在过去的十年中，由慢性ERS引起的细胞损伤已被越来越多地认为是广泛的人类流行疾病的病理生理学的核心因素。例如，ERS和持续的UPR信号已经在糖尿病、神经退行性变、卒中、肺纤维化、病毒感染、炎症性疾病、癌症和心脏病中的作用已经有了很多的研究发现。在这些看似不同的疾病中，共同的主题是细胞内和（或）细胞外各种条件的影响下，破坏蛋白质折叠，导致错误折叠的蛋白质在内质网中积累。UPR通路的遗传突变与人类罕见的糖尿病和其他疾病有关，这有力地支持了ERS可能导致疾病的观点。对于上述许多疾病，特定UPR成分的遗传操作已被证明会影响啮齿动物模型中的疾病结果。现有的将ERS与疾病联系起来的临床前数据以及UPR中潜在靶点的出现，很可能会在未来几年内引导对UPR靶向的药物进行人体临床试验。下面讨论一些与ERS最密切相关的疾病。
（1）糖尿病：胰腺β细胞合成、储存和分泌大量的多肽激素胰岛素。据估计，每个人的β细胞平均每分钟产生大约100万个胰岛素分子。为了应对周围血糖水平的升高，分泌颗粒中预先包装好的胰岛素由细胞释放，并通过合成得到补充。当胰岛素与外周组织中胰岛素反应细胞上的受体结合时，信号转导级联就发生了。胰岛素与靶细胞结合后，葡萄糖进入，产生能量。同时，随着血糖水平的正常化，胰腺β细胞进一步释放胰岛素的刺激就被移除。但是在糖尿病患者中，这种葡萄糖苷循环是失调的，因为在禁食和餐后状态下，为了维持正常的血糖水平，需要大量的功能性β细胞来产生所需数量的胰岛素，而对糖尿病患者这个功能性β细胞数量来说是不足的。
为了支持高水平的胰岛素分泌，β细胞含有高度发育的内质网。胰岛素的生物合成需要一系列复杂的分子生物合成事件，这些事件在β细胞内质网中启动。胰岛素的前体，前胰岛素原，被共翻译转运到内质网腔，随后其信号序列被剪断，产生胰岛素原。内质网驻留氧化还原酶催化胰岛素原中三个分子内二硫化物的形成，使其折叠成天然形状。这一关键的氧化折叠步骤在秋田糖尿病小鼠突变体（Akita diabetic mouse mutant）中被中断，该突变体表达胰岛素原变异基因Ins2（C96Y）秋田胰岛素（Akita insulin）。Ins2（C96Y）缺少一种半胱氨酸，这种半胱氨酸是形成分子内二硫键所必需的，而二硫键有助于Ins2在内质网中折叠；因此，在秋天小鼠中胰岛素原的运输受到阻碍，不像野生型胰岛素原，后者正常地被运输到下游的高尔基体和分泌颗粒，在那里它被内蛋白酶进一步加工，去除其C肽生成成熟的胰岛素。
秋田小鼠把ERS与细胞凋亡和糖尿病联系了起来。尽管秋田小鼠保留了三个正常的胰岛素基因拷贝（小鼠有两个不同的胰岛素编码基因），但是由于β细胞的丢失，秋田鼠会出现胰岛素分泌不足的情况。秋田胰岛素主要引起毒性功能获得糖尿病综合征。秋田胰岛素作为一种构象改变的未成熟物质在内质网中蓄积，作为一种蛋白毒素，耗尽稳态UPR输出并触发终端UPR反应，这导致秋田小鼠的β细胞进入凋亡途径，出生后4～5周内患上frank糖尿病。在秋田小鼠中，通过基因操纵方法移除CHOP（PERK下游的一种促凋亡转录因子）或者IRE1α靶点TXNIP，可改善β细胞丢失和糖尿病，这进一步强调了终端UPR在β细胞退行中的重要作用。
在PERK敲除小鼠中，也发现明显的隐性糖尿病源性UPR异常。编码UPR传感器PERK的基因纯合子缺失，大量β细胞快速凋亡，从而导致糖尿病。同时研究发现，Perk基因敲除小鼠在生命早期会进一步发展为胰腺外分泌功能不足并表现出生长缺陷。这些缺陷被认为是继发于几种重要的专业分泌细胞类型的功能障碍和死亡。有趣的是，糖尿病是基因突变动物中最早出现和最严重的表型之一，这也再次凸显了β细胞对ERS的易感性。一种由PERK无效基因突变引起的罕见的人类糖尿病综合征（称为Wolcott-Rallison综合征）也表现出和PERK基因敲除动物的许多相同特征。这些都表明内质内膜内未折叠蛋白质的积累和UPR关键功能的去除可促进细胞凋亡，从而导致糖尿病的发生。
（2）神经退行性变：许多神经退行性疾病的一个病理特征是错误折叠的蛋白质和蛋白质聚集在受影响的神经元和周围的支持细胞中。在阿尔茨海默病中，在神经纤维缠结中观察到tau的细胞内沉积，在老年斑中可以看到淀粉样β的细胞外聚集物。进行性核上性麻痹（progressive supranuclear palsy，PSP）的病理学表现为tau蛋白在整个新皮质、基底节和脑干的细胞内缠结。在帕金森病中，神经元胞质中可见泛素化的Lewy小体（由α-突触核蛋白组成）。一些遗传性肌萎缩性侧索硬化症（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是由SOD1（超氧化物歧化酶1）中毒性的功能获得点突变导致其聚集而引起的。其他神经退行性疾病，如亨廷顿病（Huntington's disease，HD）是由含有扩展的谷氨酸重复序列的突变蛋白（如亨廷顿蛋白）引起。突变体SOD1和突变体亨廷顿蛋白聚集，耗尽26S蛋白酶体活性，导致内质网中错误折叠蛋白质的二次积累。众所周知，朊病毒可以组织成蛋白质聚集物，并在一系列传染性海绵状脑病的发病机制中起重要作用，包括克雅病（Creutzfeldt-Jakob）和库鲁病（kuru）。除了单个蛋白质中的罕见遗传突变破坏其正常折叠，退化的神经元还暴露于许多其他损伤（如氧化应激、炎症、代谢紊乱），这些损伤也可能会破坏蛋白质折叠并导致ERS。
在这些神经退行性疾病中，蛋白质聚集体如何导致选择性神经元丢失的确切机制仍在研究中。有证据表明，神经退行性组织中的大蛋白聚集体（如包涵体）具有保护作用，而较小的错误折叠蛋白质物种（如纤维）具有毒性。有毒蛋白质的积累会杀死神经元，越来越多的证据表明ERS是导致这种神经毒性的一个重要机制。IRE1α激活和UPR诱导在AD、PD和ALS的死后脑和脊髓组织中存在。此外，在HD、PD和ALS的细胞和动物模型中，蛋白质聚集体的积累与UPR的激活密切相关。在最近的一项研究中，发现了一个编码PSP基因的独立基因位点，该基因与PSP的过度活动相关。来自克雅病患者的大脑样本显示许多内质网伴侣和其他ERS标志物的激活。散发性ALS患者尸检时脊髓节段显示ERS导致UPR、伴侣和凋亡标志物的产生。研究人员在突变型SOD1小鼠身上使用在体报道系统发现UPR在神经肌肉失去神经支配的早期迹象出现前的25～30天前就在选择易感性（但不是抗病）的运动神经元中被激活。再加上有证据表明突变体SOD1，而不是野生型SOD1，导致内质网中错误折叠蛋白质的二次积累，这些发现强烈表明受影响的神经元试图通过激活UPR来管理内质网中错误折叠蛋白质的积累。重要的是，UPR的上调在症状出现之前就被观察到，这表明UPR在疾病中起着积极的作用。
基于这些数据，研究人员最近开始在神经退行性变小鼠模型中操纵UPR，并发现了一些有希望的结果。例如，在APP/PSI转基因AD模型中，Perk的条件性缺失改善了突触功能障碍。此外，最近的一项研究发现，口服一种高选择性PERK抑制剂可以有效地跨越血脑屏障，显著降低朊病毒感染小鼠的神经退行性变和临床疾病。与人类患者体内UPR激活的有力证据相结合，这类研究引起了人们对UPR的药理学操作可能对多种神经退行性疾病有改善这一观点的高度关注。
（3）心脏病、卒中与缺血再灌注损伤：ERS与缺血再灌注损伤之间的联系已在多个层面得到研究证实。动脉阻塞或低血压导致的血流量减少会导致组织缺氧和低血糖，这两种情况会迅速导致蛋白质折叠错误和ERS。当血流恢复时，受影响组织的再灌注会导致氧化应激和内质网氧化还原状态的改变，从而破坏蛋白质二硫化物的形成并导致内质网蛋白质错误折叠。在人类和各种动物模型的动脉粥样硬化斑块中都有UPR激活的证据。有证据表明，高胆固醇、脂肪酸和氧化应激可触发ERS诱导的与动脉粥样硬化斑块相关的巨噬细胞和内皮细胞凋亡，并加重动脉粥样硬化的进展。心肌梗死区内及邻近心肌细胞激活UPR。此外，小鼠Ask1基因缺失部分保留了冠状动脉结扎后的左心室功能，提示末端UPR是心肌梗死时心肌细胞丢失的重要因素。同样，受中风影响的大脑区域也显示出ERS诱导的凋亡的证据，与野生型对照组相比，缺乏CHOP基因的小鼠在卒中损伤后的神经元丢失减少。
（4）癌症：肿瘤细胞常侵袭或转移到环境恶劣的环境中，例如，缺氧、缺糖、乳酸酸中毒、氧化应激和氨基酸供应不足，都会影响内质网中的蛋白质折叠。因此，许多研究发现，UPR的三个信号通路（PERK、ATF6、IRE1α）在多种原发性人类肿瘤类型中持续、高水平激活，包括胶质母细胞瘤、多发性骨髓瘤和乳腺癌、胃癌、食管癌和肝癌。基因组筛选已经在一小部分的人类实体肿瘤中发现了IRE1亚型中罕见的体细胞突变。大量的报道也显示内质网蛋白质折叠机制的组成部分，尤其是伴侣Bip/GRP78在癌症中过表达，其表达水平与疾病进展相关。
然而，尽管有大量证据表明在多种癌症中存在持续的ERS和UPR激活，这些过程是否最终抑制或促进了患者的肿瘤生长仍然是一个值得深入研究的领域。大多数认为UPR支持肿瘤生长的证据来自小鼠的异种移植研究，在这些研究中，从基因上删除UPR的一个或多个通路或改变内质网伴侣Bip/GRP78的表达可以抑制肿瘤细胞的体内生长。例如，人类胶质瘤细胞系中IRE1α基因缺失导致血管生成减少，肿瘤生长减少。IRE1α-XBP1信号通路可诱导多种促血管生成因子，如血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），这可能是UPR这一分支促进实体瘤生长的机制之一。这些发现表明，不仅稳态UPR经常在肿瘤中被激活，而且它可能是癌细胞在ERS条件下生存和/或生长所必需的。
骨髓瘤是一种由恶性浆细胞组成的高分泌性肿瘤，UPR常被认为是一种潜在的有吸引力的靶点，因为有强有力的证据表明该途径对浆细胞的发育至关重要。在小鼠中，IRE1α及其稳态靶点XBP1都是B细胞分化为浆细胞所必需的，说明分泌途径在该细胞类型的健康生长中起着关键作用。有趣的是，高达50％的原发性骨髓瘤显示异常高水平的xbp1。此外，在B淋巴细胞中表达Xbp1s转基因（缺少26个nt内含子，因此无须IRE1α进一步处理）的小鼠会发展成类似骨髓瘤的浆细胞恶性肿瘤。也有证据表明，用硼替佐米（Velcade）抑制蛋白酶体，被美国食品和药物管理局批准为骨髓瘤的一线疗法，通过阻止ERAD途径处理错误折叠的蛋白质，从而触发ERS诱导的凋亡，部分导致骨髓瘤细胞死亡。最近，在这些发现的基础上，在人类骨髓瘤异种移植物上测试了几种IRE1αRNase活性的药物抑制剂，发现它们具有抗肿瘤活性。然而，这些药物的特异性和脱靶效应还不清楚。