胚胎植入前遗传学诊断的诊断技术选择策略
胚胎植入前遗传学诊断（PGD）的适应证包括染色体病、非整倍体筛查、单基因病、线粒体病、HLA配型等多个方面，这要求在单细胞或者极微量的几个细胞状况下，能够鉴别染色体或者基因是否异常。目前已建立了单细胞水平的染色体核型分析、荧光原位杂交（FISH）、聚合酶链反应（PCR）、染色体芯片和新一代测序等5种PGD技术平台。选择合适的PGD技术平台，需要考虑各个技术的操作难度、适应范围、准确率和误诊风险等多个方面。
（一）主要的PGD技术介绍
1.染色体核型分析
核型分析一直是确定染色体是否异常的金标准，但是，人类植入前胚胎基本处于有丝分裂的间期，无法直接进行染色体核型分析。人们从精子注射入仓鼠卵母细胞从而诱发精子中期染色体得到启发，可将极体或单卵裂球与卵母细胞融合诱导得到中期染色体，即核转化技术。核转化技术包括两种方法：一种方法是将单卵裂球注射入去核卵母细胞或去核异常受精的合子的周隙空间中，后者被给予了一个电刺激，引起细胞融合，胞质内的细胞因子诱发注入的单卵裂球进入有丝分裂中期。另一种方法是用牛的卵母细胞诱发，并用秋水仙素处理得到中期染色体。诱导的染色体可用G-显带技术或全染色体涂染检测，也可用光谱核型分析（SKY）或24种颜色标记的多色FISH分析。其中SKY技术已用于检测卵和极体的染色体异常。但总体来说，该技术难度很大，而且所制备的染色体形态差。因此，目前通过核型分析的PGD技术，除极少的实验室仍在坚持外，基本已被淘汰。
2.荧光原位杂交
（1）原理：FISH是20世纪70年代末、80年代初开始发展起来的一种重要的非放射性原位杂交技术，是一种分子细胞遗传学技术。其原理是通过荧光标记的DNA探针结合到特定染色体的互补序列上，杂交后可以在荧光显微镜下检查，荧光信号的数目可推算探针所在的染色体或者染色体片段数目。应用不同的荧光标记，一次可同时杂交几个探针，目前在一轮FISH检查中就能检查一个单细胞中1～5条染色体。
（2）发展史：1974年，Evans首次将染色体显带技术和放射性标记的染色体原位杂交，即FISH技术，提高定位的准确性。1981年，Harper成功地将单拷贝的DNA序列定位到G显带标本上，标志着染色体定位技术取得了重要进展。20世纪90年代，随着人类基因组计划的进行，由于绘制高分辨人类基因组图谱的需要，FISH技术得到了迅速的发展和广泛应用。
FISH技术的发展主要沿着两条路线前进：一方面是采用不同的探针，从而衍生出许多FISH技术，如多色FISH、CGH、染色体涂染、反向染色体涂染、RNA-FISH等；另一方面则是努力提高FISH技术的分辨率，将靶目标从中期染色体（1～3 Mb）发展到DNA纤维，使其分辨率由1 Mb发展到1 kb，这更进一步拓展了FISH技术的应用领域，成为分子细胞遗传学的一项代表技术。
FISH首次应用于PGD领域是在1995年。
（3）优缺点：FISH具有直观、简单、低成本、实验重复性强等诸多优点，不需要长时间的复杂的细胞遗传学技能的培训。这个优点特别适合于PGD的检测，特别适用于染色体数目或者结构异常的PGD检测。但是，FISH技术所使用的探针有限，不能检测所有的染色体异常。同时，在单细胞水平应用FISH技术时，容易受到固定失败，探针质量达不到要求、信号弱或者信号重叠、信号弥散、背景信号过高等因素的影响。
（4）适用范围：FISH技术是以制备的染色体片段或者基因探针为基础的技术。在PGD中，FISH技术适用于以下情况：①FISH技术最适用于染色体罗伯逊易位、相互易位和倒位等染色体结构异常的携带者等高危人群进行染色体异常的检测；②适用于针对高龄、反复植入失败、反复自然流产等高危妊娠的女性进行植入前染色体非整倍体筛查（PGS）；③针对不能进行植入前胚胎基因分析的性连锁遗传病，FISH也可通过性别鉴定的方式，避免妊娠性连锁遗传病胎儿；④针对大片段缺失的单基因病（如DMD，SMA），也可应用FISH技术进行单基因病的PGD。
3.聚合酶链式反应
（1）原理：聚合酶链式反应（PCR）是依据DNA碱基互补配对的原理，在体外通过变性、退火、延伸三个阶段的不断循环，将特定的微量DNA片段扩增数百万倍以供进一步的遗传分析的技术。由于植入前胚胎可供检测的材料极其稀少，因此，基本上所有的单基因病的PGD，都依赖于扩增DNA的方式。
（2）进展：世界上第一例PGD技术是基于PCR扩增Y染色体上的特异序列，以鉴别胚胎的性别。
荧光PCR是PGD中特别有用的技术。荧光PCR是PCR引物的5'端用荧光分子进行标记，扩增产物可由激光分析系统检测，能对细胞的DNA定量。荧光PCR可以用于单基因病的检测，如检出囊性纤维化3 bp大小的ΔF508的缺失。荧光PCR也能与SSCP、CCM、ARMS互为补充。荧光PCR产物检测的灵敏度是标准PCR产物的1000倍以上。
荧光定量也可检测染色体异常。其原理是扩增短串联重复序列（STR），STR是高度多态性位点，由许多不同的2～5 bp重复单位构成。许多物种的DNA包括核苷酸重复序列，重复几次或很多次，最终形成不同长度序列。同源染色体同一位点的重复单位拷贝数不同，便形成了杂合子，这些微卫星可以用于特异染色体异常的检测，如检测21-三体与18-三体。正常人是杂合子，2个等位基因的PCR产物比率为1∶1；而为三体时，PCR产物要么出现比率为1∶1∶1的三个不同片段，要么为1个等位基因的产物是另1个的2倍，比率为2∶1。QF-PCR是可靠的，灵敏度高，且能在1 d内完成。尽管大部分时候是精确的，但应用于单细胞时，由于PA现象的存在，不可靠的概率达到了25%。
全基因组扩增（WGA）是广泛应用于单细胞遗传学分析的PGD技术。有基于PCR的WGA和不基于PCR的WGA两种类型。
（3）优缺点：PCR技术具有扩增目的片段明确、快速的优点，扩增片段的保真性强，实验方法稳定。但是，对单细胞进行PCR扩增，对实验条件的要求高，易于污染。同时，单细胞的PCR，目前始终无法克服等位基因脱扣的问题。
（4）适用范围：PCR是检测单基因病的最常用方法，也是单基因病PGD的首选方法。①几乎所有的单基因病，包括线粒体病，都需要应用到PCR技术。由于在PCR基础上衍生了很多技术，具体选择何种PCR技术依据实际情况；②PCR技术亦可用于HLA分型；③选择特定的STR位点，应用荧光PCR技术亦可用于染色体异常的PGD，如染色体结构异常的携带者，或者常见染色体数目异常的检测。
4.染色体芯片技术
（1）原理：新一代的植入前遗传学诊断技术，在全基因组扩增的基础上，发展了比较基因组杂交微阵列（Array-CGH，aCGH）和单核苷酸多态性芯片（SNP-array）两种芯片技术。
aCGH的原理是将不同标记的待测DNA和参照DNA以探针的形式在芯片上进行竞争性杂交。具体而言，经过全基因组扩增之后，待检细胞DNA与参照DNA得到均匀放大，通过酶学反应将二者分别标记上红色或绿色荧光素，与固有探针的CGH芯片进行杂交。基于人类基因组序列信息，每个探针对应不同染色体特定区域。全染色体组约含6000余探针，染色体的缺失或重复通过每个杂交点的颜色显示出来（红色与绿色荧光的比例）。通过扫描仪读取芯片上每条探针信号强度，经过后期数据分析，可对染色体重复或缺失做出判断。对于红绿荧光比的分析简单且易于自动化操作。
SNP-array虽然也是运用探针排列进行微阵列，但其并非待检基因组与参照基因组竞争杂交对比分析，而是由待检基因组与玻片上固有探针进行原位杂交的阵列方式，获得检测数据与标准正常人群参照数据库比对评估分析。该技术的染色体拷贝数分析通过两种方式计算：一种是将每个SNP位点的等位基因与亲本对比，显示哪条亲本染色体被遗传至胚胎，若遗传了三条独立的亲本染色体表示三体，而所有位点的纯合性表示该染色体单体或单亲二体，由此可以提供胚胎的DNA指纹信息，追踪移植胚胎的去向；而另一种的计算方法是对比待检与对照标本的杂交荧光密度，待检标本的杂交信号相对较强则为三体，相对较弱则为单体。SNP-array技术的应用优势在于检测片段重复缺失或非整倍体同时还可检测单倍体及多倍体异常，还可提供胚胎指纹鉴定，亲缘性分析及单亲二体的检测相关数据。
（2）进展：Array-CGH的前身是中期染色体比较基因组杂交（mCGH）。自2001年起，有学者将其应用于植入前遗传学筛查，成功分娩了健康女婴。mCGH原理即为不同荧光素分别标记的待检DNA与参照DNA竞争杂交于正常男性中期染色体上，软件照相分析染色体颜色，黄色为正常，偏红或偏绿均提示重复或缺失。该法的缺陷在于劳动强度大，手工操作烦琐，分析结果受杂交效率的影响，也存在人为分析误差。随着技术进步，mCGH发展为以细菌人工染色体（BAC）为杂交载体，提升了分辨率；再到目前国际广泛应用的Array-CGH，杂交载体变为阵列探针，分辨率可达到5 Mb左右。
SNP-array应用的是单核苷酸多态性（SNP）原理，基因组水平上单个核酸的变异引发DNA序列多态性，因此检测SNPs可以得到基因分型结果。在植入前胚胎水平上，正常染色体拷贝数为2，只需判定染色体拷贝数变异（CNV）即可分辨胚胎是否发生了染色体的重复或缺失。该技术以往常被用于肿瘤或基因分型的研究，2008年首次在PGS应用中取得成功。
（3）优缺点：芯片技术应用于植入前遗传学诊断相对于传统技术优势明显，此类技术特点是除了对易位或倒位染色体进行植入前诊断之外，还能对其他染色体非整倍体异常进行筛查。且芯片试验有标准流程，仪器扫描，基于基因组水平分析的技术，能够得到软件标准分析结果，降低人为判读误差。
就Array-CGH而言，优势是节约时间，全面的染色体分析可在48 h之内完成，控制在鲜胚移植的时限之内。而其缺陷是由于基因组的比较性分析，无法区分单倍体或三倍体的整倍性变异。
与Array-CGH相比，SNP-array 探针间隔较密，长度可为25～85个核苷酸。根据芯片类别，几十万甚至上百万的探针覆盖了全基因组，能灵活使用于判定染色体非整倍体及片段重复或缺失的问题。SNP-array技术的应用优势在于检测片段重复缺失或非整倍体，同时可检测单倍体及多倍体异常，还可提供胚胎指纹鉴定，亲缘性分析及单亲二体的检测相关数据。但目前应用SNP-array的缺陷是检测时间需3 d左右，需要结合胚胎玻璃化冷冻技术进行冻胚周期移植。
不论哪种芯片，使用成本都较高，可以采用调整组合检测方式减轻患者经济负担。
（4）适用范围：芯片技术不同类型有不同的探针密度，可对应不同病例选择不同芯片。Array-CGH适用于非整倍体筛查及染色体整臂的重复缺失检测；SNP-array相对更精，除了非整倍体筛查之外，可检测平衡易位产生的不平衡胚胎，已报道过的最小分辨率在2.6 Mb。此外，随着技术的发展，芯片密度和特定位点设计探针逐步增加，应用领域也逐步拓宽，包括亲缘性分析或单亲二体分析等，可为受检者及医师提供更多的信息及临床指导。
5.新一代测序技术
测序技术的发展起源于20世纪90年代的人类基因组计划，自从人类基因组被完全破译后，第一代测序技术应运而生，采用的是碱基修饰聚合酶延伸的方法，毛细管电泳逐个读取序列。第一代测序技术广泛应用于单基因病的突变检测，包括单基因病的植入前遗传学诊断。
自2006年发展起来的新一代测序（NGS）技术，将全基因组测序技术引入了普通实验室，测序通量逐步上升，而成本逐步下降。2012年，通过全外显子深度测序检测单细胞基因获得成功。2013年，应用大规模平行测序技术对植入前胚胎的活检细胞全基因组扩增产物进行PGD检测获得成功应用，当测序的数量据约为200 M（测序深度约×0.08）时，可检出全染色体非整倍体及大片段重复或缺失。
新一代测序包含DNA文库的建立、乳液PCR、微珠分选、测序芯片杂交及扫描、数据分析等操作步骤。随着技术发展逐步简化操作流程，缩短时间，及扩展检测范围，测序在植入前胚胎领域的应用将逐步扩大加深。
当测序深度升高，在不久的未来有可能区分出平衡易位和正常胚胎，排除平衡易位携带者的后代延续风险；调整测序的方式，也可能应对于单基因病携带者进行全基因组测序，在排除基因病风险的同时检出染色体非整倍体；还可能在预防医学领域发展个人基因组筛查等，前景广阔。
（二）不同适应证的PGD技术选择
1.染色体结构异常
携带染色体结构重排的夫妇，包括染色体相互易位、罗伯逊易位、插入易位、复杂易位及染色体倒位等。最常见的类型是罗伯逊易位和相互易位。罗伯逊易位有15种类型，其中10种非同源染色体的罗伯逊易位可以通过PGD助孕。平衡的相互易位是目前在需要PGD的夫妇中发现的最常碰到的染色体重排，理论上断点可以发生在任何染色体的任何位点。因此，相互易位的种类繁多。
染色体结构重排的携带者有原发或者继发不孕的风险，如果能够生育，产生染色体不平衡配子的比例也很高，属于高危妊娠。其中，罗伯逊易位携带者在减数分裂时可形成至少6种不同配子，其中4种是不平衡的配子，两种平衡的配子中，一种为完全正常，一种为携带者父母相同的易位。相互易位携带者在减数分裂时的情况要复杂些，需形成四倍体才能完成同源染色体片段的配对。四倍体在分离时，理论上至少可以产生18种不同的配子，其中只有1种正常的配子，一种平衡的配子，其中16种都是不平衡的配子。
选择合适的探针，应用单细胞的间期核FISH技术可以区分平衡的配子和非平衡的配子，从而达到PGD助孕的目的。减数分裂模式是选择探针的依据，原则上探针选择时需要能区分全部的非平衡胚胎，同时兼顾可存活的非平衡染色体可能误诊的情况。关于探针选择的原则，在2005年版和2011年版的欧洲ESHRE协会PGD指南有详细的描述。理论上，在每一条染色体上选择一个探针，就可以用于罗伯逊易位的PGD。在相互易位对应的两条易位染色体的着丝粒远端各选一个亚端粒探针，另选一个相应易位染色体的着丝粒，就可以应用于相互易位的PGD。对于倒位及其他的染色体结构异常，也都可以根据减数分裂的模式选择合适的探针。
常用的商业探针（着丝粒探针和亚端粒区探针）无法区分正常染色体和易位染色体。要达到这个目的，需要自己制备探针，从BAC文库中筛选到跨断点的探针。但这个过程非常烦琐，在实际中很少使用。
2.非整倍体筛查
非整倍体筛查是针对高龄、反复植入失败和反复自然流产的特殊的PGD方法，迄今为止已经实行的超过半数的PGD周期是为了与年龄相关的非整倍体的通用筛选。早期大多数组织使用探针检测X，Y，18，13和21号染色体，这些染色体占产后的染色体异常总数的95%。完成一轮FISH后，可以通过处理，将杂交信号洗脱，进行第二轮的杂交。最终可通过3～4轮FISH杂交，将筛选的染色体数目提高到12条。然而，荟萃分析及多个中心的随机对照试验结果显示，基于FISH的非整倍筛选不能提高活产率，而且降低临床妊娠率。因此，目前应用FISH技术进行非整倍体筛查，尽管风靡一时，但自2007年后，已很少在临床上使用。
近年来，由于染色体芯片的临床应用，PGS重新进入人们的视野。染色体芯片，包括Array-CGH和SNP-array技术，可以检测所有的染色体的非整倍体及片段的异常，而且减少了手工操作的时间，与FISH技术相比，理论上具有明显的优势。目前已有多个生殖中心启动了芯片为主的非倍体筛查的实验，目前需要更多的随机对照研究来验证其有效性。
3.性别鉴定
X-连锁遗传病已超过400种，占全部单基因病的6%～7%，多数呈X连锁隐性遗传，如杜氏营养不良症（DMD）和血友病。这些疾病中，母亲携带了一条突变的X染色体，有一半的机会将有缺陷的基因遗传给她的后代。女性后代获得这条有缺陷的染色体将可能成为与其母亲一样的携带者，而获得有缺陷X染色体的男性将成为X-连锁遗传病患者。尽管性别选择不是一种理想的PGD方式，母亲为携带者的X-连锁隐性遗传病为例，性别选择可能淘汰了50%的男性正常胚胎，保留了50%的携带者女性胚胎。但迄今仍有很多X-连锁遗传病突变位点不明，或者相应地PGD技术难以建立，因此，性别鉴定仍是一个可选的方案。
有两种方式可用于性别鉴定，一种是PCR技术，第一例PGD临床应用就是通过PCR技术对X-连锁疾病夫妇扩增Y染色体长臂上的一段重复序列而完成的胚胎性别鉴定。另一种技术是FISH技术。相对而言，FISH技术更直观，误诊风险较少。而且，FISH不仅可以诊断性别而且可以确定性染色体的拷贝数。但是，PCR技术可以选择多个位点，目前准确度也相当高。
4.单基因病
单基因病的PGD都是基于PCR平台。由于单基因病种类多，而且可供诊断的细胞只有一个或者几个，对于微量细胞的基因检测有等位基因脱扣、污染和扩增失败等风险，因此，单基因病的PGD都是针对特定的遗传病。在实施PGD前，首先必须通过遗传咨询和家系调查弄清该家族的遗传病的遗传方式，并通过基因诊断了解该遗传病的确切突变，才能通过PCR技术进行该遗传病的植入前诊断。以患者外周血为材料的基因诊断方式有多种，在查到了某种遗传病的突变位点后，就可采用针对该突变位点的特异引物通过PCR技术对单卵裂球进行检测，以确定相应胚胎有无异常。
5.线粒体病
人类线粒体DNA（mtDNA）是一个长16 569 bp的环状双链分子，分轻链和重链，含37个基因，编码呼吸链和能量代谢有关蛋白。mtDNA缺失或者点突变，使线粒体氧化代谢必需的酶或载体发生障碍，糖原和脂肪酸不能进入线粒体，产生ATP量减少，能量代谢障碍，从而导致复杂临床症状，即线粒体病。线粒体病包括线粒体脑病、线粒体肌病、线粒体脑肌病等。
几乎所有受精卵的线粒体均来自卵母细胞，线粒体病的遗传方式与孟德尔遗传不同，属于母系遗传方式，将线粒体传给女儿，并通过女儿可将mtDNA传递给后代。每个细胞的mtDNA有多重拷贝，因此线粒体编码基因表现型与细胞内突变型和野生型mtDNA相对比例有关，只有突变型达到某一阈值，患者才出现症状。母系遗传及阈值效应的特点，给线粒体病的PGD带来很大的困难。
6.HLA分型
与其他PGD不同，HLA基因分型的PGD技术不是直接针对遗传病，而常常是用于家庭的再生育，以救助患病的同胞。HLA基因分型的PGD技术也是以PCR为基础的技术，包括PCR-SSP（序列特异性引物）、PCR-SSO（P）（序列特异性寡核苷酸探针杂交，包括正向/反向，膜杂交/微珠杂交/芯片杂交）及PCR-SBT（测序为基础的HLA分型）等方式。对植入前胚胎的进行HLA基因分型，并不属于传统意义上的PGD技术，其本身亦有很大的争议。从技术策略来讲，是基于PCR的PGD。