基于荧光原位杂交的PGD技术
（一）FISH-PGD的关键实验步骤
1.胚胎活检标本（卵裂球或囊胚滋养层细胞）裂解及细胞核铺展固定
（1）低渗：在体视镜下，用毛细玻璃管针（针尖口径略大于卵裂球或囊胚滋养层细胞团的直径）将胚胎活检标本从胚胎活检培养基微滴中转移到NaAc（1%，w/w）/BSA（6 mg/mL）低渗液液滴（50μL）中，室温条件下低渗5 min。
（2）固定：在体视镜下，用毛细玻璃管针将胚胎活检标本转移到干净载玻片上的5μL固定剂（0.01 M HCl/0.1%Tween-20）中，并吸去多余的部分液体，待液体挥发将尽未尽时，迅速用另一根干净的玻璃针加入适量的固定剂。对于单卵裂球标本，直到细胞轮廓在视野中逐渐消失，室温条件下，待固定剂自然挥发将尽未尽之时，视细胞质去除效果，可反复添加固定剂，直至见到清晰完整的细胞核；对于囊胚滋养层细胞团标本，迅速用另一根干净的玻璃针加入适量的固定剂（0.01 M HCl/0.1%Tween-20），使囊胚滋养层细胞团悬浮在固定剂液滴中，并采用机械法，用毛细玻璃管针尖通过戳、拨和挑等方式直接将悬浮在固定剂液滴中的囊胚滋养层细胞团尽量分散成单个游离的细胞，待固定剂自行挥发干净即可。并用金刚笔在玻片背面画个小圆圈做标记，或者在普通光的低倍镜视野下记录下细胞核所在位置的坐标。
（3）每固定完成一个胚胎活检标本后，及时在实验记录单上记录对应胚胎活检标本在玻片上所对应的准确区域并编上唯一对应的胚胎序号。
（4）继续重复以上低渗和固定步骤，将所有的卵裂球或囊胚滋养层细胞标本按特定的顺序和合适的间距全部固定在载玻片上，并在实验记录单上及时准确地做好记录。
（5）标本老化处理：将玻片放入60℃烤箱中烘烤2 h。
（6）RNase A处理：在玻片标本区加40μL RNAase A溶液（0.1 mg/mL），盖上一层蜡膜后，将玻片放入湿盒中于37℃处理30～50 min，再用2×SSC于室温洗2 min，依次放入70%、90%、100%的酒精中脱水各2 min，室温晾干玻片。
2.探针、玻片变性及杂交
（1）探针变性：按试剂说明书解冻配制探针混合液，所有用于FISH-PGD的探针必须有包括生产批次、有效期、对应染色体特异性位点、标记荧光素种类等在内的明确标识，探针混合物于75℃水浴变性5 min。
（2）玻片变性：玻片于75℃变性液（70%甲酰胺/2×SSC，pH7.0）中变性5 min，酒精梯度脱水迅速风干玻片。
（3）将已变性探针10μL夹在玻片标本区，依次盖上小、大两层蜡膜，将大的那层四周压紧，再用透明胶包扎密封玻片，并将玻片放入湿盒中于37℃杂交过夜（16 h）。如果探针混合物全部为着丝粒位点探针，则杂交37℃杂交1 h后即可获得满意的杂交信号。
3.杂交后洗脱、DAPI复染和荧光显微镜观察信号
（1）洗脱：小心揭去透明胶和蜡膜，玻片依次于洗脱液Ⅰ［WS-Ⅰ：甲酰胺50%（v/v）、10%（v/v）20×SSC、40%（v/v）蒸馏水］中45℃洗3次×2 min，洗脱液Ⅱ（WS-Ⅱ：4×SSC/0.05% Tween-20）中室温条件下洗3次×2 min，洗脱液Ⅲ（WS-Ⅲ：4×SSC）中室温条件下洗1次×2 min，梯度酒精脱水风干玻片。
（2）结果观察：加5μL DAPI（0.2 mg/mL）复染，盖上盖玻片，于暗处复染20 min后用荧光显微镜观察信号，用FISH软件拍照保存图像。
4.结果判定及报告
由两名FISH实验员按照相同的荧光信号判断标准分别单独进行FISH信号判定，若两人对同一胚胎活检细胞标本FISH信号判定一致，则该枚胚胎按两人判定一致的FISH信号发报告，如果两人判定结果不一致，则该枚胚胎建议不予移植，且判定为FISH结果不确定或需进一步应用其他探针进行验证确定。FISH实验员必须将FISH信号观察判断结果如实准确地记录在FISH-PGD实验记录单上并签名确认。FISH信号判断标准：若2个荧光信号之间的距离大于1个信号斑的距离，则判断为2个独立的信号，否则判断为1个信号；对于囊胚滋养层活检标本，则在2个或2个以上细胞核中杂交信号一致的基础上进行判断。
卵裂球标本FISH-PGD必须在胚胎活检后36 h内出FISH诊断报告，囊胚活检标本FISH-PGD（活检后胚胎冷冻保存）必须在胚胎活检后7 d内出FISH诊断报告，FISH诊断报告必须先由FISH实验员打印出纸质报告单、核对FISH结果并签名，再交给遗传中心主管人员审核签名并由专人负责发送到IVF实验室活检技术人员手中。必须当给IVF实验室出具书面的纸质版PGD报告单，以确保移植正确的胚胎。不允许口头告知结果。
5.FISH玻片保存
如果已经有一枚胚胎移植了或冷冻保存，则所有的FISH玻片都应妥善储存。如果是没有胚胎移植或冷冻保存，则不需要保留FISH玻片。如果新鲜或冷冻的胚胎移植后没有着床妊娠，则所有FISH玻片可以被废弃。如果有妊娠，则所有FISH玻片应予以保留，直到确知妊娠结局或FISH结果得到证实。
6.文件存档(https://www.daowen.com)
FISH-PGD手术通知单一份，胚胎活检记录单一份，FISH实验记录单一份，报告单复印件一份，所有FISH原始图均备份刻盘保存。
（二）国际上对于FISH-PGD技术的几个指导原则
FISH可以用于X-连锁疾病胚胎性别鉴定、遗传性染色体重排检测和非整倍体筛查（PGS）。
1.X-连锁疾病的性别鉴定
（1）建议应用X和Y染色体的着丝粒探针，且至少设置一个常染色体对照探针。
（2）一个单核细胞可用于性别鉴定。
（3）应当指出，在排除X-连锁疾病的植入前性别诊断方面，基于FISH检测的性别鉴定不如基于PCR检测的性别鉴定好。PCR性别鉴定不但可以排除女性携带者，还能选择出正常的男性胚胎。
（4）染色体探针可以检测非整倍体，如果进行多轮FISH检测，则X和Y探针应在第一轮优先进行检测。
2.染色体重排
（1）检测重排染色体的探针组合应包含能够检测所有可能的不平衡的染色体重排的胚胎。FISH探针选用原则：对于罗伯逊易位携带者选用相关两条染色体位点特异性探针（分别用红色和绿色荧光标记）；相互易位携带者选用相关两条染色体易位片段上的亚端粒探针（分别用红色和绿色荧光标记）和两条染色体中任意一条的着丝粒探针（以天蓝色荧光标记）。探针使用的原则是，所选择的探针必须能把相关染色体不平衡产物区分开来。
（2）对于那些已经评估认为在可辨识的妊娠里不可能出现或发生率很低的部分非平衡染色体异常，如果没有合适的探针组合，用其他的不能检测这些非平衡染色体异常的探针混合物也是允许的，但必须由一名细胞遗传学家或符合资格的人员确定具体使用什么探针组合。
（3）在单个单核细胞的诊断中，对于那些在可辨识的妊娠里易于出现或有可能使胚胎存活的不平衡的染色体异常，需至少应用两个能检测出这些不平衡染色体异常的有效的探针组合。
（4）如果只有一个可用的探针组合，对于囊胚滋养层细胞FISH-PGD，推荐在两个或两个以上的单核细胞诊断结果一致的基础上进行诊断。
（5）允许应用与重排染色体异常无关的额外的探针检测非整倍体。
（6）对于易位或倒位的检测，PGD的FISH报告应清楚地说明，不能区分核型正常与平衡易位或倒位核型的胚胎。
3.非整倍体筛查（PGS）
对于非整倍体筛查，推荐设置至少包括13、16、18、21、22、X和Y等8对染色体的探针。也可以增加其他额外的探针检测。
（三）质量控制
我国对PGD的质量控制没有明确的规定。参照《美国临床胚胎技术员培训指南》，我们做出以下质量控制参考。
1.单卵裂球标本固定人员，在进行患者单卵裂球标本的固定处理之前，必须通过培训，能够单独连续成功固定50个单卵裂球。
2.必须用每对拟行FISH-PGD治疗的夫妇的外周血淋巴细胞培养标本进行FISH预实验，夫妻双方各观察计数20个中期相和100个间期细胞核中相应探针的荧光信号，评估选择将要用于检测单卵裂球标本的FISH探针组合的有效性。
3.FISH实验操作必须在专用的暗室中进行。
4.在进行玻片变性操作时，必须用温度计检测水浴箱的准确温度；杂交过程中必须确保恒温箱或杂交仪的温度及电源稳定。
5.用于单卵裂球标本检测的FISH探针组合必须在FISH预实验的基础上由两名符合资格的分子细胞遗传学专业人员确定。
6.所有FISH试剂必须在有效期内使用，在用于临床标本检测之前必须事先进行FISH预实验验证所配制试剂的质量；不同批次的FISH探针不能混合使用。
7.FISH结果必须由两名FISH实验人员按照相同荧光信号判断标准单独进行判定。
8.必须向IVF实验室出具纸质版的FISH诊断报告单，以确保移植正确的胚胎。