三、精卵融合
(一)穿透透明带与精卵识别
精子与卵子接触后,它们需相互识别才能发生融合,这种识别是精子与透明带分子和精子与卵母细胞膜上分子识别,具有物种特异性。
1.透明带与透明带糖蛋白
精子克服卵丘细胞的障碍后,需识别、黏附和穿透透明带,才能最终与卵子相遇。透明带与精子必须相互识别。
透明带由卵子外周的糖蛋白组成,因为在光镜下呈现为均值透亮结构,称为透明带。透明带是由卵母细胞合成并经高尔基复合体分泌的糖蛋白。小鼠卵母细胞研究显示,透明带由透明带糖蛋白ZP1、ZP2和ZP3组成。ZP2和ZP3异二聚体形成长纤状结构,再通过ZP1使之交联,形成三维结构的基质。基因敲除研究证实了ZP1、ZP2和ZP3在形成小鼠透明带和维持其超微结构具有重要的意义。人类透明带还存在另一种透明带糖蛋白,称为ZP4,其意义尚不明确。
2.精子与透明带的识别
透明带作为精子屏障,通过糖蛋白壳上的受体与精子头部的特定物质识别,与精子结合,这种结合具备物种特异性。ZP3是精子的第一受体,ZP2是第二受体。当精子与ZP3结合后,诱发精子的顶体反应,继而使之与ZP2结合,最后穿透透明带。但是到目前为止,这种特异性识别与结合的详细机制尚不明确,相关研究提供了一些线索。
应用转基因的方式使小鼠卵母细胞表达人ZP3,但人类精子却不能与小鼠卵母细胞产生的人类ZP3结合,即使是同时使小鼠卵子表达分泌人ZP4,精/透明带间的结合仍然不能发生。这提示人精子与卵母细胞透明带结合的物种特异性不但依赖ZP3,还依赖于4个组成透明带的糖蛋白构成的超微分子结构。精子与透明带间的物种特异性识别和结合与透明带糖蛋白外壳外露的碳氢基团有关。与ZP3相关的寡糖O连接与小鼠的精/透明带识别与结合有关,聚糖的N链接也参与了该过程。事实上,将人类透明带聚糖氧化,可以减少精/卵的结合,但不能完全阻断这一过程;使用基因敲除方式,缺乏O和N连接的聚糖的卵子也可以受精,预示着精/透明带的识别与结合涉及许多系统,包括蛋白-蛋白、碳氢化合物-蛋白和尚未发现的其他识别系统。
电子显微镜观察到小鼠透明带在成熟的过程中,糖连接在位置、密度和分布上不断发生变化,在人卵子透明带也有同样的现象,推测它与超微结构成熟状态相关。透明带伴随卵子成熟的超微结构变化预示着它在调节精/透明带特异结合的重要意义。
3.精子与卵母细胞膜的识别和黏附
当精子结合并通过透明带后,越过卵周间隙,与卵膜接触。通过电子显微镜观察,卵膜外表被覆着微绒毛。卵膜表面的微绒毛变化很大,有些卵母细胞极为丰富,有些较少,甚至缺乏。由于在精/卵融合中微绒毛包绕精子,这些微绒毛被认为在这一过程中具有重要的作用。通过一系列的分子作用,精子黏附在卵膜上,最后细胞膜融合。
尽管目前还不能确定导致精/卵融合的受体-配体和参与融合的蛋白质,但卵膜上的CD9引起了高度的关注,它在精/卵融合中具有关键性的作用。CD9属于四分子交联体蛋白家族成员,是细胞表面糖蛋白。它有四个跨膜域,与其他细胞表面蛋白形成多聚体,在许多细胞功能方面发挥作用,包括分化、黏附和信号传导。其基因CD9位于染色体12p13.3。CD9在卵母细胞获得受精能力前后分布于卵膜表面,在微绒毛区域最为丰富。无论是使用CD9抗体中和,还是CD9缺陷小鼠模型,都会导致精/卵融合减少甚至完全缺失。(https://www.daowen.com)
其他一些卵膜相关的蛋白如糖基磷脂酰肌醇(GPI,一种锚蛋白)也显示参与了精/卵识别与融合过程。敲除使卵母细胞GPI的合成缺陷将导致不孕,卵母细胞与精子的结合能力急剧下降。
整合素是胞质-胞膜蛋白,能与四分子交联体蛋白结合形成复合体,参与精子结合和融合。精子方面的配体尚未明确,目前认为卵母细胞膜四分子交联体蛋白与整合素形成的复合体,再与精子头部的ADAMS如 fertilin 相互识别与融合构成精/卵结合的受体-配体关系。但目前ADAMS是否就是精/卵识别的配体还有一些争议。
(二)精子和卵母细胞融合
精/卵之间的黏附是胞膜融合的起始。而精/卵黏附由位于精子与卵母细胞膜表面的受体-配体分子介导。当一对分子发生黏附后,另一对的结合就会使膜之间的距离更近一些,最后导致构象的变化激活非特异性的融合多肽,插入已经相互靠近的精子与卵母细胞细胞膜。随后多肽分子聚集并扩大开口,最终导致细胞膜融合形成一个融合口,并扩大促进精/卵完全融合。
精子与卵子通过CD9和GPI识别后,发生细胞膜融合而进入卵母细胞。精子的对应配体可能是ADAMS
(三)精子穿入的调节
保障卵母细胞只与一个精子融合是形成正常胚胎的基本条件之一。当精子与卵子融合后,卵子必须发生一定的反应,才能保障这一目的的实现,包括钠内流和皮质反应。
1.钠内流
精子与卵膜后在1~3秒内激发卵膜的Na+内流反应,防止多精受精,是受精生理的快速、可逆的反应机制。Na+内流使卵细胞膜电位由-70 mV(静息电位)增高到+20 mV。当卵子膜电位增高后,它就失去了与精子细胞膜融合的能力。还不明确Na+通透性增加是由于精子膜与卵膜结合激发,还是精子与卵母细胞融合激发的。Na+内流是短暂的,只能维持数分钟。它导致的卵膜电位改变随着K+外流而恢复静息状态。随后防止多精受精的作用由不可逆的、依赖于细胞游离钙激发的皮质颗粒反应所取代。
2.皮质颗粒反应
卵母细胞膜下的皮质层存在皮质颗粒,它是溶酶体,高尔基复合体的产物,含有蛋白水解酶、结构蛋白和黏多糖等。卵与精子融合后,在细胞内Ca2+的激发下,皮质颗粒膜与卵质膜在精子与卵子相接触的位点发生融合,皮质颗粒内容物释放到卵周间隙,随后波及整个卵表面。皮质颗粒成分通过过氧化物酶催化蛋白质发生交联,ZP2裂解为ZP2 f,修饰ZP3,精子受体失活,使透明带硬化(透明带反应)。皮质颗粒反应为合子和卵裂阶段的胚胎提供一个保护层,阻止多余精子的再结合和穿过。