单细胞全基因组扩增技术
（一）技术介绍及分类
全基因组扩增（WGA）是一种对全部基因组序列进行非选择性扩增的技术，在相对没有序列倾向性的前提下大幅增加DNA拷贝，获取大量的遗传信息，可将其扩增产物作为模板DNA，采用PCR、RFLP、STR、CGH、SNP等方法对产物进行多位点、多基因及全基因组的研究。
根据扩增原理，应用于胚胎植入前遗传学诊断的常用的WGA方法可以分为两大类：第一类是基于PCR的WGA，以引物延伸预扩增（PEP）和简并寡核苷酸引物扩增（DOPPCR）为代表；第二类是基于非PCR原理的多重置换扩增（MDA）。近年，受MDA扩增原理的启示，又出现了新的全基因组扩增技术-多重退火环状循环扩增（MALBAC），该技术将MDA与PCR结合，可有效控制扩增效率和评估产量。
（二）引物延伸预扩增
1992年，Zhang等使用一条15个碱基的寡核苷酸随机引物，37℃低温条件下引物与DNA退火、然后以0.1℃/s缓慢升温至55℃，并维持4 min进行延伸，随机扩增整个基因组DNA。50个循环后，单倍体的精子、卵细胞或极体约有78%的基因序列能扩增30倍以上。这种技术称为引物延伸预扩增。
PEP可对大部分基因进行扩增，由于产量低无法用常规方法检测PEP产物大小的分布，但根据后续巢式PCR产物，估计某些片段在800 bp以上。通过改善原有PEP的反应体系及热循环条件后，该技术又命名为改良的扩增前引物延伸反应（I-PEP）。2005年Hanson等在I-PEP的基础上，增加dNTP、随机引物和高保真酶的用量，实现对5 pg的模板DNA进行检测（1个二倍体细胞DNA量为6～7 pg），有效提高扩增产物特异性及STR检测灵敏度，称之为改良I-PEP（mIPEP）。经改良后的I-PEP产生片段长度可达23 kb。
目前PEP已用于多种基因病植入前遗传学诊断中，如假肥大型进行性肌营养不良、囊性纤维化疾病、泰-萨克斯病、β-地中海贫血、家族性淀粉样变性、家族性腺瘤性结肠息肉病、甲型血友病等，另外单核苷酸多态性（SNP）分型、ABO及Lewis血型分型等都可通过PEP实现。然而，较低的扩增率、高度多态性微卫星重复序列非平衡扩增等一系列问题限制PEP广泛运用。
（三）简并寡核苷酸引物扩增
1992年，Telenius等设计了简并寡核苷酸引物 PCR（DOP-PCR）。DOP-PCR引物序列为5'-CCGACTCGAGNNNNNNATGTGG-3'，3'端的ATGTGG序列是一种频率极高的DNA短序列，退火时起引导作用，中央6个随机序列起加固引物与DNA的结合作用，5'端的CCGACTCGAG序列则用于末端修饰。低温退火条件下，引物能与众多基因组DNA位点（在人类约有109）连接。反应呈两步法扩增：最初几个循环（3～5个）设置低退火温度（30℃），使引物在DNA链的全长范围随机退火连接并延伸，产物片段两末端分别为引物5'端的CCGACTCGAG序列和其互补序列；在第二步继续进行的25～35个PCR循环则类似普通PCR原理，退火温度升高至62℃，引物进行特异性连接延伸，按比例均匀扩增整个基因组DNA，并能获得较高的扩增效应，扩增产物大小在300～1700 bp，平均500 bp。
DOP-PCR是一种发展较为完善并被广泛接受的WGA方法。该项技术在各种DNA分析技术中得到应用，如SNP分型、微卫星基因分型、比较基因组杂交（CGH）、Array-CGH、单链构象多态性（SSCP）分析等许多方面。其中，以DOP-PCR为基础的CGH技术，在传统荧光原位杂交（FISH）技术与G显带技术间架构一座桥梁，应用于PGD中能够诊断包括染色体非整倍体性、易位、缺失、断裂等改变，在检测染色体的部分增加或缺失方面表现甚至优于FISH技术与G显带技术，然而一些较小的染色体改变如远端断点易位易被忽略。
值得注意的是，Tan等学者联合应用PEP和DOP-PCR技术，以PEP作为预扩增，将基因组剪接为大小不一的小片段，再经DOP扩增单细胞全基因组DNA，最后通过CGH分析单细胞的染色体拷贝数变化。结果显示PEP-DOP-PCR技术优于单纯的DOP-PCR技术，很好地克服了传统DOP扩增失败、扩增不均匀等问题。单细胞全基因组扩增可在6 h内完成。
（四）多重置换扩增
以PCR为基础的WGA方法的缺陷包括：全基因组位点覆盖率相对低，保真性较低；非特异性产物较多；微卫星位点扩增效率低；扩增产物平均长度小于1 kb，不利于后续遗传学分析。
1998年，Lizardi等建立了一种基于环状滚动扩增原理的链置换扩增技术即MDA。2001年，Dean把MDA引入人类基因组扩增，为人类全基因组扩增提供了一种新的、有效的方法。MDA基本原理：引物为经过硫代磷酸修饰具有抗核酸内切酶活性的随机六聚体，引物可在多个位点与基因组模板DNA退火结合，在30℃恒温条件下，phi29 DNA聚合酶在多个位点开始合成新的DNA链取代模板互补链，被置换出新的DNA链又成为模板来进行扩增，形成级联放大系统，最终生成高拷贝量的优质模板DNA。
1.phi29 DNA聚合酶
在多重置换扩展中起关键作用的phi29 DNA聚合酶兼具3'-5'核酸外切酶校读活性，能够将DNA合成的错配率降至106～107之间；在30℃恒温条件下具有高效卓越的持续合成能力，每次能持续扩增7万个碱基而不解离，所以能够产生集中均一的长片段DNA产物；phi29对DNA模板具有很强的结合能力，即使遇到DNA的初级和次级结构等阻碍，也能够非常紧密地结合在模板DNA链上进行复制。
2.对MDA的评价
（1）MDA的优势：①扩增产量高且产量稳定。基因组DNA经过30℃反应4～16 h，MDA扩增达到高峰后维持在一个稳定水平，使所有反应的DNA产量几乎相等。100μL的反应体系中，无论起始模板量差别多大，扩增后的DNA产量都一致保持在20～30μg左右，十分稳定；②扩增产物平均长度12 kb，最长可达100 kb；③随着初始模板量/细胞数的提高，扩增基因组覆盖率明显增高。Ling等通过10K SNP-array 评估MDA产物，发现单细胞MDA的基因组覆盖率为86.2%，而对5个细胞及10个细胞的扩增则可分别达到90.4%和96.3%；④常温等温下扩增，可避免高温下DNA降解对扩增产物质量的影响，有效提高了扩增特异性。
（2）任何技术都会存在缺陷，MDA也不例外。需要注意的问题及改善方法有：①有效产物。MDA是一种滚环扩增方法，引物六聚体随机结合在模板链的任意位置同时开始复制，复制形成的新链随即又成为一条新的模板，在整个复制过程中MDA产物如同一个树叶脉络状的立体复制结构，DNA链彼此交织缠绕，呈现一种絮状立体空间构型。将MDA产物进行琼脂糖电泳时，可见加样孔中滞留了大量的产物，只有一部分DNA产物游离出来，这些游离的DNA产物才是在后续试验中起作用的部分，称之为有效产物。而絮状复合物中的DNA链因为受空间构型的限制，增加了变性和结合引物的难度，会影响后续PCR反应。当后续实验对模板质量要求高时，建议将MDA产物纯化后使用。②仍存在等位基因优势扩增（PA）和等位基因脱扣（ADO）问题。但随着初始模板量增加时，PA及ADO可得到明显的改善。Ling等发现随着起始模板从单细胞提升至10个细胞，MDA产物的平均ADO率从17.9%逐渐下降至0.1%。对体外受精胚胎进行非整倍体筛查时，为了避免MDA产物ADO发生率对结果的影响，至少使用7个已知的遗传标记才能保证诊断的可靠性。据报道，MDA的脱扣率在10%～30%左右，所以建立MDA检测体系时，需要各实验室对产物的ADO进一步检测，以便确保产物能如实的代表全基因组。③某些特定位点扩增效率低或不扩增。如GC含量高、重复序列和端粒/着丝粒附近区域可影响MDA。④易污染。由于MDA敏感性高，模板量少，扩增体系极易污染。Ling在空白对照中检测到5.3%的人源基因组信号。PGD中污染物可主要来源于精子、颗粒细胞、实验环境及酶本身等。污染物与模板竞争扩增，MDA产物经PCR放大后极大影响了诊断的准确性。⑤MDA对细胞DNA质量要求高，腐败、降解的DNA将影响扩增效率。这要求在PGD中尽量活检形态完整的细胞。
3.MDA在PGD中的应用
（1）MDA在基因病PGD中的应用。2004年Hellani等首次将MDA应用到植入前遗传学诊断中，联合PCR和CGH技术成功诊断β-地中海贫血和21-三体。目前MDA已应用于囊性纤维化病、脆性X综合征、马方综合征、杜氏肌营养不良、X-连锁隐性遗传脑白质肾上腺萎缩症、Zellweger综合征、X-连锁隐性遗传的先天性视网膜劈裂症等基因病PGD中。
（2）MDA在染色体病PGD中的应用。MDA联合STR和荧光定量PCR技术，可同时检测多个染色体的数目异常，例如对胚胎进行13，18，21-三体诊断。Array-CGH技术也可以完成对染色体异常的筛查，显示了MDA在染色体病PGD中的广阔应用前景。
（3）MDA在对植入前胚胎进行HLA分型联合或不联合基因病诊断的应用。目前对植入前胚胎进行HLA配型的PGD联合或者不联合单基因遗传病检测包括①单基因病：地中海贫血临床检测最多，其次是范可尼贫血、镰状细胞性贫血、先天性中性粒细胞减少症等；②免疫缺陷疾病：湿疹-血小板减少-免疫缺陷综合征、X-染色体连锁的高免疫球蛋白M综合征、X-染色体连锁的无汗性外胚层发育不良症伴免疫缺陷、共济失调毛细血管扩张综合征、Omealn综合征、急性淋巴细胞白血病、急性髓系白血病先天性纯红细胞再生障碍性贫血、伯基特淋巴瘤等；大部分免疫缺陷病不符合单基因遗传病的遗传规律，涉及多基因位点遗传，致病位点不明确，并受后天环境多种因素影响而无法进行有效检测，最有效的治疗方法是造血干细胞移植。目前对胚胎进行HLA分型的策略多为单细胞全基因组扩增后检测HLA基因簇中紧密连锁的杂合STR位点（通常在8个以上），进行单体型分析，也有联合测序技术直接分析HLA基因序列。
（五）多重退火环状循环扩增
如前所述，phi29是一种高效的DNA聚合酶，任何核酸序列都可以得到大量扩增，这使得MDA扩增反应难以控制。2012年，Lu等在MDA基础上引入PCR反应，设计出了多重退火环状循环扩增（MALBAC）技术。
单细胞被分选及裂解后，基因组DNA在94℃下熔解成单链。8个碱基的随机引物在0℃退火到单链DNA分子多个位点上，65℃时在聚合酶置换作用下延伸，产生半扩增子。在接下来的5个循环内，以半扩增子和单链DNA分子为模板又可生成更多的半扩增子和全扩增子，因全扩增子的3'端与5'端互补故杂交形成DNA环，从而有效阻止全扩增子被当成模板，由此达成基本线性的扩增。在五个线性预扩增循环后，仅全扩增子应用27-碱基通用序列引物进行PCR，产物呈指数级放大。
MALBAC扩增操作较简便，经过细胞裂解、预扩增和指数式扩增3步完成，整个反应时间约4 h。Lu的研究显示，在65μL反应体系中，单细胞或等量DNA通过MALBAC扩增反应可获得范围在300～2000 bp之间的扩增产物2～4μg。扩增成功率达95%以上。基因组覆盖率达93%，可在AT-GC富集区得到准确、高度重复的连续扩增结果，与MDA相比更能真实地反映基因组DNA。暂未见多重退火环状循环扩增技术在PGD中的应用报道，但确是一种值得期待与尝试的新方法。