卵母细胞玻璃化冷冻复苏方案
该方案采用的冷冻载体为拉细麦管，拉细麦管在装入胚胎后需要热封口，稍增加了操作过程，但由于是封闭载体，能更好地预防污染。
（一）设备
1.移液泵。
2.体视显微镜。
3.标签机。
4.麦管移液器。
5.计时器。
6.热封口机。
7.液氮罐。
8.护目镜。
9.水浴箱。
10.剪刀。
11.培养箱。
（二）耗材
1.15 mL无菌离心管。
2.培养皿。
3.巴氏吸管。
4.无菌手套。
5.冷冻管架。
6.冷冻架套管。
7.10 mL移液管。
8.1 mL移液管。
9.拉细麦管（内径200μm）。
10.1 mL注射器及能与拉细麦管连接的连接管。
（三）配制冷冻液和复苏液
1.W：HEPES缓冲地HTF＋白蛋白（12 g/dL）。
2.ES：W＋7.5%乙二醇＋7.5%二甲基亚砜。
3.VS：W＋15%乙二醇＋15%二甲基亚砜＋0.5 mol/L蔗糖。
4.T1：HEPES缓冲地HTF＋白蛋白（12 g/dL）。
5.T2：T1＋0.5 M蔗糖。
6.T3：T1＋1.0 M蔗糖。
溶解后用0.22μm滤器过滤除菌。
（四）冷冻
冷冻在室温中进行。(https://www.daowen.com)
1.在培养皿上，用W做1个液滴，ES，3个液滴，VS，4个液滴，每液滴20μL（图11-1），将卵母细胞移入W液滴，1 min。
2.用巴氏吸管将ES1液滴的液体拖向W液滴，使二者连接起来，不必移动卵母细胞，定时2 min。
3.同法，将ES1液滴的液体拖向W液滴，使二者连接起来，不必移动卵母细胞，定时2 min。
4.将卵母细胞移入ES3，3 min。
5.将卵母细胞移入VS1，5秒。
6.将卵母细胞移入VS2，5秒。
7.将卵母细胞移入VS3，10秒。
8.将卵母细胞移入VS4。
9.将胚胎和VS4吸入拉细麦管（顺序如下）。
10.先吸0.5 cm左右VS4。
11.再吸卵母细胞及VS4，0.5 cm。
12.VS4，3 cm。
13.用热封口机在拉细麦管的两个末端热封。
14.立即投入液氮。
在VS4内的操作过程应该在90秒内完成。
（五）复苏
1.复苏前准备卵母细胞培养皿，在CO2培养箱内平衡4 h以上。
2.取1个培养皿，用T3做1个液滴，T2，2个液滴，每液滴20μL。
3.取出冷冻地拉细麦管，37℃水浴3～5秒。
图11-1 卵母细胞玻璃化冷冻液滴的制备
4.擦干麦管表面。
5.在拉细麦管粗端剪掉麦管的封口，连接上注射器或麦管移液器。
6.将拉细麦管细端停留在T3液滴上方，剪掉细端。
7.用麦管移液器将麦管内液体，包括卵母细胞推在培养皿表面，形成一个小液滴，靠近T3液滴。
8.吸取T3液滴内液体，在含卵母细胞的液滴边上推出，与之大小类似。
9.将两个液滴连接起来，等待1 min。
10.卵母细胞移入T3液滴，等待1 min。
11.卵母细胞移入T2-1号液滴，等待2 min。
12.卵母细胞移入T2-2号液滴，等待2 min。
13.此时做T1液滴3个。
14.卵母细胞在每个T1液滴内停留2 min。
15.将卵母细胞移入卵母细胞培养皿，等待4 h后ICSI。