胚胎程序化冷冻和解冻具体操作
（一）材料和用具
1.无菌培养皿。
2.10 mL移液管。
3.巴氏尖吸管（由巴氏吸管拉制，用于转移胚胎）。
4.0.25 mL冷冻麦管。
5.吸胚枪。
6.0.22μm无菌过滤器。
7.止血钳、镊子、无菌纱布、手术剪、保温桶等。
（二）仪器设备
1.液氮罐。
2.CO2培养箱。
3.超净工作台。
4.体视显微镜（有热台）。
5.计时器。
6.程序冷冻仪及其附属设备。
（三）冷冻液（F）
1.F1：20% HSA+PBS。
2.F2：20%HSA+PBS+1.5 mol/L PROH。
3.F3：20%HSA+PBS+1.5 mol/L PROH+ 0.1 mol/L source。
（四）解冻液（T）
1.T1：20%HSA+PBS+1 mol/L PROH+ 0.2 mol/L source。
2.T2：20%HSA+PBS+0.5 mol/L PROH+ 0.2 mol/L source。
3.T3：20%HSA+PBS+0.2 mol/L source。
4.T4：20%HSA+PBS。(https://www.daowen.com)
将上述冷冻液和解冻液经0.22μm无菌过滤器过滤分装后，放到-4℃冰箱保存备用。
（五）程序化冷冻流程
1.核对患者夫妇姓名和冷冻胚胎数目，需完全一致。
2.用巴氏尖吸管吸取培养皿中的胚胎转移至冷冻液F1中，静置5 min。同时观察并记录胚胎形态。
3.将胚胎移入F2中15 min。
4.将胚胎移入F3中15 min，期间根据胚胎数目和要求冷冻的麦管数目将胚胎进行分组。除特殊要求外，要求优级和次级混合搭配，均匀分配。
5.在F3时间内，按照液-气-液的顺序将2～3枚胚胎装入麦管，插入相应麦管头，然后放入程序冷冻仪。
6.麦管放入冷冻仪前需再次检测加热泵、气压表及冷冻仪面板程序是否正常。如正常，则按照3根麦管/孔放入冷冻仪中开始冷冻程序。
7.冷冻仪中冷冻程序起始温度为20℃，以-3.0℃/min的速度降至-7℃。
8.手动植冰，植冰温度：-7℃。
9.植冰后以-0.3℃/min的速度降温至-30℃。
10.再以-30℃/min的速度降温至-150℃。
11.程序结束后收集麦管于液氮中永久存放，并将胚胎存放位置和冷冻资料信息进行登记备案。
（六）解冻流程
1.解冻当日，再次核对患者胚胎冷冻协议书与胚胎冷冻储存库信息是否一致，如男女方姓名、病历号、冷冻号、胚胎冷冻日期、冷冻数目、管数、冷冻胚胎麦管头颜色及标记、胚胎储存位置等。如完全一致则进行下一步工作。
2.准备解冻设备、试剂和耗材，并根据胚胎冷冻信息将患者的冷冻胚胎麦管从液氮罐中取出并转移到小型液氮桶内，运到实验室。
3.将装有胚胎的麦管，从液氮中取出并在空气中停留40秒。
4.将麦管放入30～34℃左右的无菌温水中孵育1 min，待冷冻液完全融化。
5.将麦管从温水中取出，用无菌纱布轻轻拭去麦管外壁的水珠。
6.用无菌手术剪剪掉麦管一段封口，放入显微镜下的无菌培养皿上，剪掉另一端，使麦管中的液体包括胚胎一起释放到显微镜下的无菌培养皿中。
7.用尖吸管迅速找到胚胎并转移到T1中5 min。
8.然后，分别依次转入T2、T3、T4液中各5 min。
9.再放到37℃温箱10 min。
10.根据患者的年龄和医嘱，将1～3枚胚胎转入移植皿待移植。